201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
45 PH05mRNS MU 201115 B 46 GAATA AGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGGAATTCC ATGJ'CT TA CL CAA.... Met Ser Tyr Gin...... PH05 mRNS start -----------PH05 DNS 10 ................linker DNS----------- TPA DNS Ezek a kiónok azonosak és a p31ííL (TPA (12-2) jelzést kapták. 15 10. Példa A gén-konstvukciók szab-klónozása a nagy kópia-számú pJDB207 élesztővektorban (lásd 20 17. ábra). mennyiségben keverjük a pJDB207 6,2 kb méretű Hindlll-Sull fragmentjóvel. A ligálást 4 órán ét 15 °C-on végezzük 100 pl össztérfogatban. A ligáié elegyból 10 pl-t használunk kompetens E. coli HB101 sejtek transzformálására a 4a. példában leírtak szerint. Számos ampR telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Ilindlll és Sáli restrikciós endonukleázzal emésztve vizsgáljuk a beépített szakasz méretét. A helyes beépített szakaszt tartalmazó klón a pJDB207/P/7O5-TPA (12-2) jelölést kapja. 11. Példa A 9. példában leírt konstrukció a pBR322-ból származó vektorba egymás után beépítve tartalmazza PH05 promotert a szig- 25 nálszakasz nélkül a TPA-2 kódoló szakaszt és a P1I05 transzkripciós terininációs szakaszt. Élesztőben való kifejeződés céljából az egész beillesztett szakaszt leucin protolrófiára való szelekciót lehetővé tevő pJI)13207 (22) élesz- 30 tővektorban szubklónozzuk. 2 pg p3lRL/TPA (12-2) DNS-t emésztünk Sáli és Hindin restrikciós endonukleázokkal. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os preparativ alacsony olvadáspontú agarózgélen vá- 35 lasztjuk el, és a kis 2,8 kb méretű fragmentet 0,8%-os preparativ alacsony olvadásponté agarózgélből izoláljuk. A DNS fragmenteket tartalmazó géldarabokat 65%-on megolvasztjuk és az agaróz koncentráció 0,3%-ra csők- 40 kentése céljából vízzel higitjuk. A p31RL/TPA (12-2) plazmid 2,8 kb méretű Sall-HindlII fragmentjét ekvímoláris A Saccharomyces cerevisiae GRF18 transzformálása A pJDB207/P//O5-TPA(lA), pJDB207/PH05- -TPAa 1, pJDB20/P//05-TPAA 2, PJDB207/P//O5-TPAa 3, pJDB207/PHO5-TPAA 4 és pJDB207R/P//O5-TPA( 12-2) plazmidokat a Hinnen és munkatársai által leirt eljárás (12) alkalmazásával külön-külön bevisszük a Saccharomyces cerevisiae GRF18 (alfa, his3- -11, his3-15, leu2-3, leu2-112, canR) törzsbe. Mindegyik plazmid DNS-ból 1 pg-ot adunk egy szferoplaszt szuszpenzióhoz és a keveréket polietilén glikollal kezeljük. A szferoplasztokat 10 ml regeneráló agarba keverjük és leucint nem tartalmazó élesztő minimál agarlemezre szélesztjük. 3 napig 30 °C-on inkubálva kb. 200 transzformált sejtet kapunk. Mindegyik élesz tő-transzformálásból egy élesztőtelepet izolálunk. A különböző izolátumok a következő jelzéseket kapják. Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//O5~TPA( 1 A), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//O5-TPA a 1, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//O5-TPA a 2, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/P//O5-TPA a 3, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJD0207/PP05-TPA a 4 és Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/P//O5-TPA (12-2). Az élesztősejteket 30 °C-on 100 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő élesztőtáptalajban 24 órán át rázatva növesztjük, mig a 2-3xl07 sejt/ml sűrűséget el nem érjük. A sejteket egyszer mossuk alacsony foszfát-koncentrációjú minimál táptalajjal. A felszuszpendált sejtekből 3 ml-t használunk 1000 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 300 ml alacsony foszfát-koncentrációjú minimál táptalaj és 300 ml normál minimál táptalaj beoltására. A 55 tenyészeteket 30 °C-on 160/perc fordulatszámmal rázatjuk. A PH05 promoter indukcióját a savas foszfatáz aktivitás sejtekben való megjelenésének mérésével követjük. Tho-e és munkatársai módszerével (44). A sejteket 26- 60 -30 órás inkubálással körülbelül l-2xl07 sejt/ml sűrűségig növesztjük. 25
