201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
27 HU 201115 I) 28 végezzük. A transzformált sejtek DNS-ét megvizsgáljuk, p31 névvel látjuk el (lásd 5. ábra). A p31 expressziós plazmid tartalmazza a PR05 promoter régióját a szignálszakasz egy részével, és mellette a PII05 transzkripciós terminációs jeleket tartalmazó DNS szakaszt. Az ebben a plazmidban kifejezendő idegen kódoló szakaszokat kényelmesen beépíthejük a promoter és a transzkripciós terminációs szakasz közé. 6. Példa A PH05 szignálszakaszának deléciója a p31 expressziós plazmidból (lásd 7. ábra) A p31 expressziós plazmid tartalmazza a PH05 promoterszakaszt, ideértve a mRNS start-helyet, a savas foszfatáz ATG transzlációs start-kodonját, és további 40, a savas foszfatáz szignálszakasz egy részét kódoló nukleotidot. Ebben a konstrukcióban a szignálszakasz nukleotidjait és az ATG tripletet Bal31 emésztéssel elimínáljuk. EcoRI linkereket építünk be, melyek lehetővé teszik a PH05 promoter és az érett TPA-t kódoló szakasz összekapcsolását. a) A Ball-gyei hasi Lőtt p30 plazmid emésztése Bal31-gyel 20 jug p30 DNS-t (lásd 4b példa) emésztünk a Ball restrikciós endonukleázzal, ennek eredményeképpen két, 3,7 és 5,1 kb méretű, fragmentet kapunk. Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-L 0,5 pg/ml koncentrációban oldjuk 10 niM TRiS(pH8,0) pufferban. 9 pg Ball-gyel emésztett p30 DNS-t emésztünk 100 pl 20 mM TR1S pH 8,0 199 mM nátrium-klorid, és 1 mM EÜTA összetételű oldatban, 2 egység Bal31 exonukleázzal (BHb). 2-2 pg DNS-t 15-30-45-00 másodperces 30 °C-os inkubálás után kiveszünk és rögtön összekeverjük 60 /ul fenollal és 60 pl TNE-vel. Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 100 Mg/ml koncentrációban oldjuk 10 mM TR1S (pH 8,0) oldatban. A Bal31-es exonukleázos emésztés mértékének megállapítására mindegyik időpontból kivett 0,5 pg DNS-t DamllI endonukleázzal emésztünk és 1,5%-os agaróz-gélen, pH 8,3 Tris-borát pufferban vizsgáljuk. 45 másodperces Bal31-es emésztés után átlagban 70 bázispár hiányzik a fragment mindkét végéről. A további kísérletek céljaira a 45 másodperces emésztés után kapott DNS-t használjuk. b) EcoRI linkerek hozzákötése a Bal 31- -gyel emésztett BNS-hez Két Azso egység EcoRI linkért (5’-GG AA TT CC-3’, BR1) oldunk 250 pl 10 mM TRIS 16 (pl 18), 1 mM EDTA oldatban. Két pg EcoRI linkért 75 pl 60 mM TRIS (pH 7,5), 10 mM magnézium-klórid, 15 mM DTT, 10 pM ATP összetételű oldatban 33 egység T4 polinukleotid-kinázzal (Boehringer) kezelünk. Egy órás, 37 °C-os inkubálás után ez elegye! hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, majd -20 “C-on tartjuk, A kezelt kétszálú EcoRI linkereket tompa végűkkel a Bal31--gyel kezelt DNS fragmenlekhez kapcsoljuk. Fél mikrogramm Bal31- -gyel kezelt DNS-t (lásd 6a. Példa) 16 órán át, szobahőmérsékleten 50-szeres feleslegben lévő, kináz enzimmel kezelt EcoRI linkcrrel együtt inkubálunk 20 pl 60 mM TRIS (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 10 niM DTT, 4 mM ATP összetételű oldatban, 600 egység T4 DNS-ligózzal (Biolabs). Miután a T4 DNS ligázt inaktiválLuk, az EcoRI línkerek feleslegét 50 egység EcoRI enzimmel (Boehringer) 50 pl lélfogntban lehasítjuk. A DNS-t fenol- kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 10 mM TRIS, l mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Az EcoRI restrikciós endonukleáz nemcsak a két (3,7 kb és 5,1 kb) Ball fragment végéhez hozzáadott EcoRI linkereket hasítja le, hanem az 5,1 kb fragment belsejében levő EcoRI helyen is hasít, így kapunk egy, 3,9 kb és egy 1,2 kb méretű fragmentet. A 3,7 kb és 3,9 kb méretű fragmenteket 0,8%-os alacsony olvadáspontű agarózon (Sigma), 90 mM Tris-HCl (pH 8,3) 90 mM bórsav ób 2,5 mM EDTA összetételű pufferben választjuk el az 1,2 kb méretű fragmenttől, A DNS sávokat etidium-bromiddal festjük és hosszú hullámú (366 nM), UV-fénnyei tesszük láthatóvá. A két nagy 3,7 kb és 3,9 kb méretű fragmentet nem választjuk el. Ezeket egyetlen géldarabban kivágjuk a gélből és a 4a. példában leirL módon extraháljuk. Az EcoRI tapadó végű lineáris fragmenteket lígálással körbe-zárjuk. A fragmentekből kb 0,25 pg-ot ligálunk 100 pl 60 mM Tris (pH 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT 1 mM ATP összetételű oldatban 600 egység T4 DNS ligázzal, 4 órán át 15 °C-on ínkubálva az elegyet. A ligáló elegyből 10 pl-es alikvotokat adunk 100 pl kalciummal kezelt transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejthez (lásd 4a. példa). 35 transzformált ampR telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai (26) módszerével állítjuk elő, majd EcoRl/BamllI kettős emésztéssel elemezzük. c) Nukleotid-sorreml meghatározás az EcoRI linker hozzáadása helyének meghatározására A 35 klón legtöbbje különbözik egymástól abban, hogy az EcoRI linker hol kapcsolódik a PII05 promoter régióhoz, attól függő-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
