201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
29 HU 201115 U 30 ea, hogy mennyire emésztettük meg Bal31- -gyel az egyes DNS molekulákat. A nukleotid-sorrend meghatározása céljából a plazmid DNS-t EcoRI-gyel emésztjük. Fenol-kloroformos kizárás után az emésztett DNS-L etanollal kicsapjuk. A DNS-t defoszforilezzük és az 5’ végén megjelöljük. A jelölt DNS fragmenteket egy második restrikciós endonukleázzal, BamHI-gyel emésztjük. A termékeket 8,0%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk el. A 0,5-0,6 kb méretű, 5’-jelzett Eco- RI-Bamiil fragmentet a 4a példában leírL módon izoláljuk az alacsony olvadáspontú agarózból. Az EcoRl linker melletti szakasz nukleotid-sorrendjónek meghatározása céljából a különböző DNS-fragmenteket kémiailag lebontjuk és a termékeket poliakrilamid gélelektroforézissel választjuk el a Maxam és Gilbert által leírt módszerrel (10). A különböző kiónokat és a PH05 szakasz utolsó nukleotidjának helyét (ezután egy EcoRl linker következik) az 1. Táblázatban soroljuk fel (lásd a 8. ábrát is.) 1. Táblázat Klón PH05 szakasz utolsó nukleotidjának helye PE +25 PG + 16 pe + 15 pd + 12 PY-4 pR-10 PP-16 pv-18 pL-21 pN-22 PC-24 pH-27 pS-28 pk-29 Pl-38 pM-50 pO-53 pF-59 pm-67 PK-73 Pi-81 ph-137 d) A PHÜ5fí promolert tartalmazó 0,53 kb méretű Bamlll-EcoRI fragment izolálása A pR plazmid egy 534 bp méretű Bamlil-EcoRI fragmenten tartalmazza a PH05R promoters A 3a ábra számozása szerint a fragment a -541-es nukleotidtól (Bamlfl hely) - a -10 nukleotidig terjedő P1I05 promoter-szakaszt tartalmazza. A -10 nukleotidhoz kötött EcoRl linker két ü-csoportot ad hozzá EcoRI-gyel való emésztés után. A pit plazmidot Bandii és EcoRl restrikciós endonukleázokkal emésztjük. A 0,53 kb méretű Damlll-Ecolil fragmentet 0,7%-os alacsony olvadáspontú agarózon választjuk el, majd a 4a példában leírt, módon izoláljuk. A nu kleotid-sorrend a 9. ábrán látható. Hasonló módon, a pY plazmidot is megemésztjük és a 0,53 kb méretű, a PI105Y promotert tartalmazó BamlIl-EcoRl fragmentet izoláljuk. A nukleotid-sorrend a 10. ábrán látható. e) A p31 plazmid Sall-EcoRI fragmentjének helyettesítése az új konstrukciók Sall-EcoRI fragmentjével 5 pg p31 plazmidot (lásd 5d példa) emésztünk Sáli restrikciós endonukleázzal. Az emésztett DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 50 pl, 100 mM THIS (pH7,5) 50 mM nátrium-klorid, 5 mM magnézium-klorid összetételű pufferben oldjuk. A DNS-t EcoRI-gyel teljesen megemésztjük. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os alcsony olvadáspontú agaróz-gélen választjuk el. TRIS-borát EDTA (pH8,3) pufferban. Egy 3,5 kb méretű DNS fragmentet izolálunk egy, a DNS-sávot tartalmazó géldarabban. A pH és pY klónokból (lásd 1. táblázat 8. ábra) 5-5 pg-ot Suli-gyei és EcoRI-gyel emésztünk a fentiekben leirt módon. A 0,8 kb méretű fragmenteket az alacsony-olvadáspotú agaróz kis géldarabjában izoláljuk. A p31 vektor 3,5 kb méretű Sall-EcoRI frngmentjéből 0,67 pg-ot a pR illetve pY plazmidok megfelelő, 0,8 kb méretű Sall- EcoRl fragmentjéhez (0,34 pg) ligálunk. A DNS fragmenteket tartalmazó megfelelő géldarabokat összekeverjük és 65 °C-on megolvasztjuk. Az elfulyósítolt gélt háromszorosra hígítjuk. A ligálást 240 pl össztérfogalban, GO mM TRIS (pH7,5) 10 mM nagnézium-klorid, 10 mM OTT 1 mM ATP összetételű pufferban végezzük 750 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) éjszakán át, 15 °C-on inkubálva. A ligáid elegyekből 2-2 pl alikvot részeket 100 pl, kalciummal kezelt transzformációra kompetens k\ coli HB 101 sejtekhez adunk (lásd 4a példa). 8 transzformált ampR telepet növesztünk külőn-külön, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid-DNS-t restrikciós elemzéssel vizsgáljuk. Mindkét csoportban levő kiónok azonosak. Mindegyik klónból egyet használunk tovább és p31R, illetve p31Y jelöléssel látjuk el. (lásd 7. ábra). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
