201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
25 HU 201115 1) 26 és tetraciklin rezisztenciáját. Nyolc ampR, tets telepet izolálunk és 100 ml, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptaljon növesztjük. A plazmid DNS-t izoláljuk a sejtekből (lásd 2. példa). A BamHI enzimmel végzett restrikciós emésztés azt mutatja, hogy a 3,7 kb vektor fragment mellett (pBR322 a Ball) 4 plazmid tartalmaz egy 5,1 kb méretű DNS-darabot. A Sáli enzimmel (New England Biolabs) végzett restrikciós emésztéssel meghatározva a beépített 5,1 kb méretű BamHI fragment orientációját, megállapítottuk, hogy két plazmidban a beépített DNS darab a 4. ábrán bemutatott orientációjú. Ezek közül az egyiket p30-nak nevezzük. Az 5,1 kb méretű darabon a PH05, PH03 gének transzkripciójának iránya a 4. ábrán bemutatott módon az óramutató járásával ellentétes. 5. Példa A PH05 promotert és a PH05 transzkripciós terminációs jelet tartalmazó expressziós plazmid készítése a) Az EcoRI restrikciós hasítási hely eliminálása a p30 plazmidból 5 pg p30 DNS-t (lásd 4. példa) EcoRI restrikciós endonukleázzal (Boehringer) teljesen megemésztünk. A kapott tapadós végek feltöltése céljából 1 pg EcoRI-gyel emésztett p30 plazmidot 50 pl, 50 mM nátriura-klorid, 10 mM TRIS.HC1 pH7,5, 10 mM magnózium-klorid, 1 mM DTT, 0,25 mM dATP és 0,25 mM dTTP összetételű pufferban 30 percig 37 °C-on 1 egység DNS polimerózzal (Klenow nagy fragment, BRL) inkubálunk. Az etanolos kicsapás után kinyert DNS-t a szokásos módon ligáljuk és a 4. példában leirt módon kompetens Escherichia coli HB101 sejteket transzformálunk vele. Az EcoRI-es emésztésnek ellenálló kiónokat p30 (EcoRI") jelzéssel látjuk el. b) A 0,37 kb méretű Sau3A-PstI PH05 transzkripciós termináció fragment izolálása , A PH05 mRNS-eket SÍ nukleázos emésztéssel térképezzük (25). A transzkripciós-terminációs jeleket a PH05 gén 0,37 kb méretű Sau3A-PstI fragmenten találjuk. A Sau3A-PstI fragment nukleotid-sorrendjét a 6. ábrán adjuk meg. Öt pg pJDB 207/PHO5, PH03 DNS-t (lásd 2. példa) teljesen megemésztünk Sau3A és PstI restrikciós endonukleázokkai. A restrikciós fragmenteket 1,5%-os alacsony olvadáspontú vertikális gélen, TBE pufferben választjuk szét. A 0,37 kb méretű Sau3A-PstI fragmentet etidium-bromidos festéssel teszszük láthatóvá és a lehető legkisebb agarózdarabbal vágjuk ki a gélből. c) A PIIÜ5 Sau3A-PstI fragmotjének klónozása M13/mp 9-ben Az M13 mp 9 fág DNS-e igen hasznos, egymáshoz közel egyedi restrikciós helyeket tartalmazó klónozó vektor. 5 pg M13 mp 9 DNS-t teljesen megemésztünk BamHI és PStI restrikciós endonukleázokkai. A nagyobb, 7,1 kb méretű DNS-fragmentet 0,8%-os, alacsony olvadáspontú gélen választjuk el egy igen kicsi (8 bp méretű) fragmenttől. A gélből kivágjuk a nagy DNS fragmentet tartalmazó géldarabot. A pJDB207/PII05, PII03 plazmid (lásd 5b. példa) 0,37 kb méretű Sau3A-Pstl fragmentjét és az M13 mp 9 7,2 kb méretű BamHI-PstI fragmentjét tartalmazó géldarabokat 65 °C-on megolvasztjuk, ekvimoláris mennyiségben összekeverjük és vízzel annyira hígítjuk, hogy az agaróz-koncentráció 0,3%-ra csökkenjen. A ligálást 200 pl, 60 mM TRIS.HC1 pH7,5 10 mM MgCLí, 10 mM DTT, 1 mM ATP összetételű pufferban, 600 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) végezzük. Az Escherichia coli JM 101 (Ca2*) törzs kompetens sejtjeinek transzdukcióját a New England Biolabs által kiadott .M13 cloning and DNA Sequencing system" című kézikönyvben leírtak alapján végezzük. A fehér tarfoltokból izolált fágokat növesztjük, majd a beépített DNS-szakasz méretét EcoRI és PstI restrikciós endonukleázzal való hasítás után analizáljuk. A PII05 Sau3A-PstI transzkripciós terminációs fragmentet tartalmazó M13 mp 9 klóul izoláljuk és M13 mp 9~/PH05 (Sau3A-PstI)-nek nevezzük. d) A PI105 transzkripciós terminációs fragmenljének klónozása p30 (Eco- RIK)-ben Az M13 mp9 fágban klónozott eredeti PH05 traszkripeiós terminációs fragmentet (M13 mp9/PII05 (Sau3A-PstI) újra klónozzuk HaelII-llindlII fragmentként Ball és IiindlII enzimekkel hasított p30( EcoRI") plazmidban: az M13 mp9/PH05 (Sau3A-PstI) DNS-ét teljesen megemésztjük Haelll és Hindin restrikciós endonukleázokkai. A kapott két DNS-f ragmentet 1,5%-os alacsony olvadáspontú vertikális agaróz gélen, TBE pufferban választjuk szét. A 0,39 kb méretű fragmentet a gélből kivágott géldarab formájában izoláljuk. A p30 (EcoRI") DNS-t Ball és HindllI enzimekkel emésztjük. A nagy, 3,98 kb méretű fragmentet 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen, TBE pufferrel elválasztjuk, majd a DNS fragmentet tartalmazó géldarab formájában izoláljuk. A 0,39 kb méretű PI105 HaelII-HindlII transzkripciós terminációs fragmentet és a p30 (EcoRI") 3,98 kb méretű BalI-llindlII fragmentjét tartalmazó góldarabokat 65 °C-on megolvasztjuk és körülbelül ekvimorális mennyiségben összekeverjük. A ligálást és a kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálását a 4. példában leírt módon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
