201099. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 40926 antibiotikum mannozil-aglikon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
15 HU 201099 B 16 szerelegynek az alkalmazásával hajtjuk végre, amelyet a kiegyensúlyozáshoz használtunk; áramlási sebesség kb. 10,5 ml/perc. Az eluálást Bac. subtilis-szel végzett biológiai meghatározással és HPLC-vel követjük. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat ősszeöntjük és 5 kromatográfiás futtatás homogén frakcióit a szerves oldószer ledesztillálásóval betöményítjük. A kapott oldatot az eredeti térfogat kétszeresének megfelelő mennyiségű vizes 1 mólos nátrium-kloriddal hígítjuk és az oldatot felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (50 g, ágy-magasság 5 cm; szilanizált szilikagél 60, Merck Inc.), amelyet vízzel egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot ionmentesitett vízzel mossuk, amig a sók eltávolítása teljessé nem válik (vizes AgN03 oldat hozzáadása után az eluátumokban nem jelenik meg AgCl csapadék), majd az oszlopot 1:1 (térf./térf.) acetonitrilrviz eleggyel eluáljuk. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat (HPLC elemzés) ősszeöntjük, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményitjük be és így egy vizes fázist kapunk, amelyet fagyasztva szárítunk. Kitermelések: A 40926 antibiotikum PA faktor: 55 mg A 40926 antibiotikum PB faktor: 51 mg A 40926 antibiotikum A faktor: 38 mg A 40926 antibiotikum Bo faktor: 33 mg 6. művelet Az A 40926 antibiotikum PA faktor átalakítása A 40926 antibiotikum A faktorrá és az A 40926 antibiotikum PB faktor átalakítása A 40926 antibiotikum B faktorrá 50-50 mgA 40926 antibiotikum PA faktort, illetőleg A 40926 antibiotikum PB faktort, 2,5 ml vizes 1 tömeg/térf.X-os ammónium-hidroxidban külön-külőn feloldunk és a kapott oldatokat kb. 24 órán át keverés közben szobahőmérsékleten tartjuk. Az A 40926 antibiotikum A faktort úgy nyerjük ki az eredetileg az A 40926 antibiotikum PA faktort tartalmazó oldatból, és az A 40926 antibiotikum B faktort az eredetileg az A 40926 antibiotikum PB faktort tartalmazó oldatból, hogy a vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval eltávolítjuk, etiléteres kicsapást végzünk és a csapadékot szűréssel összegyűjtjük (kitermelés kb. 75X). A D-Ala-D-Ala-Sepharose előállítása Aktivált CH-Sepharose 4B-t (Pharmacia Fine Chemicals) - 1 g - 15 percen át 1 mmólos jéghideg sósavban duzzadni hagyunk, majd ugyanezzel az oldattal mossuk. A kapott (kb. 3 ml térfogatú) gélt őszszekeverjük egy olyan oldattal, amely 0,5 mólos nátrium-klorid - 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát puffer oldatban 30 mg D-alanil-D-alanint tartalmaz; pH 8. A keveréket 1 órán át szobahőmérsékleten síkrázógépen rázatjuk. A kapcsolási reakció befejeződése után a ligandum feleslegét a pufferrel kimossuk. A dextrén hordozó meg nem kötött aktivált csoportjait 1 mólos etanolamin-hidroklorid oldattal, pH 9-en 1 órán át végzett kezeléssel blokkoljuk. Ezután a Sephadex-epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanin módosított mátrixot szűréssel kinyerjük és alaposan mossuk, felváltva, 0,5 mólos nátrium-kloriddal és pH 4 0,1 mólos nátrium-acetáttal, majd négyszer -0,5 mólos nátrium-kloriddal és pH 8 0,1 mólos trisz(hidroximetil)aminometán pufferrel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 10
