201099. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 40926 antibiotikum mannozil-aglikon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 201099 B 14 3. művelet Az A 40926 antibiotikum AB komplex tisztítása A lényegében az el6bbi 2. műveletet követve kapott nyers A 40926 antibiotikum komplexet (750 mg; HPLC titer 70%) 400 ml vízben oldjuk, az oldat pH-ját 7,5-re állítjuk be és szűrjük. A szűrletet affinitáskromatogréfiának vetjük alá D-Ala-D-Ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose oszlopon) 50 ml duzzasztott gyanta; töltet-magasság 5 cm). Az oszlopot 0,16 tömeg/térf.%-os ammóniával, mely 2 mól NaCl-ot tartalmaz, egyensúlyozzuk ki, amelyet HCl-val pH 7,5-re állítunk be, majd egymás után a kővetkező három puffer-oldattal fejlesztjük ki: A puffer: NaCl-ra 2 mól, HCl-val pH 7,5-re beállított 0,16 töineg/térf.%-os ammónia (2,6 ágytérfogat); B puffer: NaCl-re 2 mól, HCl-lel pH 9,5-re beállított 0,16 tömeg/térf.%-os ammónia (16 ágytérfogat); C puffer: 1 tömeg/térf.%-os pH 11,4 vizes ammónia 2,6 ágytérfogat). A C puffer egyetlen frakcióban eluálja az A 40926 antibiotikum AB komplexet. Ezt az eluált frakciót pH 7,0-ra állítjuk be és újra felvisszük ugyanerre az affinitás-oszlopra, amelyet pH 7,0 10 mM TRIS-HC1 pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot desztillált vízzel mossuk, amíg a sók eltávolítása teljessé nem válik. Ezután az antibiotikumot 2 oszlopágytérfogatnak megfelelő mennyiségű pH 11,0 39 tömeg/térf.%-os vizes ammóniával eluáljuk. Az eluált frakciókat kistérfogatú vizes eleggyé töményitjük be, majd ezt fagyasztva szárítjuk. 374 mg tiszta A 40926 antibiotikum AB komplexet kapunk. 4. művelet Az A 40926 antibiotikum A és B faktor elkülönítése A) 3,3 g, a 2. művelet szerint előállított A 40926 antibiotikum komplexet vagy 2,3 g a 3. művelet szerint elöállitott A 40926 antibiotikum AB komplexet 0,5 liter vizben szuszpendélunk, a szuszpenziót kevertetjük, majd szűrjük. A tiszta szűrletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (200 g; ágymagasság 18 cm; szilanizált szilikagél 60, 0,20- -0,06 mm szitalyukbóség, Merck Inc.), amelyet előzetesen A oldattal egyensúlyoztunk ki (0,001 mól vizes nátrium-EDTA oldat, amely 0,25 tömeg/térf.% NaHjPO«-HzO-t és 2,5 tömeg/térf.% NaCl-t tartalmaz, NaOH-dal pH 6,0- -ra beállítva). Az oszlopot lineáris gradiens alkalmazásával eluáljuk (0%-40% - térf./térf. - acetonitril A oldatban; össztérfogat kb. 7 liter, kb. 48 óra alatt). Kb. 15,5 ml-es frakciókat szedünk; ezeket biológiai meghatározásnak vetjük alá Bac. subtilis alkalmazásával, és HPLC-vel elemezzük. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük. A 310-330. frakció tartalmazza az A 40926 antibiotikum A faktornak nevezett antibiotikumot, a 348-365. frakció pedig az A 40926 antibiotikum B faktornak nevezett anyagot. B) Az A 40926 antibiotikum A faktort, illetőleg az A 40926 antibiotikum B faktort tartalmazó egyesített frakciókat az acetonitril eltávolítására csökkentett nyomáson betóményitjük, (kb. a kiindulási oldatok térfogata kétszeresének megfelelő mennyiségű) vízzel hígítjuk és felvisszük az előbbiekben leírt típusú szilanizált szilikagél oszlopra (a duzzasztott mátrix térfogata 50 ml; ágymagasság 15 cm). Az oszlopot ionmentesitett vízzel mossuk, amíg a sók eltávolítása teljessé nem válik. Végül az oszlopot 60:40 (térf./térf.) acetonitrikvíz eleggyel fejlesztjük ki. Az eluált frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük és a maradékot fagyasztva szántjuk. Az eluált frakciók el6Ő csoportjából (az előbbi 310-330. frakció) 134 mg A 40926 antibiotikum A faktort kapunk, az eluált frakciók második csoportjából (az előbbi 348-365. frakció) pedig 206 mg A 40926 antibiotikum B faktort. 5. művelet Az A 40926 antibiotikum PA faktor és PB faktor elkülönítése Lényegében a 2. A) művelet és a 2. B) művelet első lépéseit követve a gyantához kötött antibiotikumot 2 x 20 liter 1 tömeg/ /térf.%-os ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumok pH-ját kénsavval 7,8-ra állítjuk be és az oldatokat vákuumban, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményitjük be. Vizes koncentrátumot kapunk, amelyet papíron szűrünk. A kapott szűrlet A 40926 antibiotikum PA faktort, A 40926 antibiotikum PB faktort és kisebb mennyiségű A 40926 antibiotikum A faktort és B faktort (HPLC) tartalmaz. Ebből a vizes koncentrátumból egy 10 ml-es mintát, amely kb. 50 mg/ml tiszta A 40926 antibiotikum komplexet (HPLC-vel végzett elemzés) tartalmaz, 5 mikrométer pórusméretű szűrőn (Acrodise*, Gelman Science Inc.) szűrünk, majd a szűrletet felvisszük egy 2 cm átmérőjű saválló acél oszlopra, amely 20 g oktadecil-szilil fordított fázisú szilikagélt (Lichrosorb RP 18, Merck Inc.) tartalmaz; részecskenagyság 10 pm. A szilikagélt ezután mérsékelt nyomáson (névleges nyomás kb. 1,4-106 Pa) betöltjük egy Chromatospac Modulprep készülék (Joben Yvon, Franciaország) saválló acél oszlopába és acetonitrikpH 6,0 18 mmól nétriumfoszfát puffer (térf./térf.) elegyével kiegyensúlyozzuk az oszlopot. Az eluálást ugyanannak az oldó-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
