201099. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 40926 antibiotikum mannozil-aglikon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 201099 B 12 4. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg, kiindulási anyagként A 40926 antibiotikum komplex helyett a) A 40926 antibiotikum A faktort, illetve b) A 40926 antibiotikum B faktort, alkalmazva, A kitermelések hasonlóak az előbbi példák szerintiekhez. 5. példa Az l.a) példa szerint előállított A 40926 antibiotikum mannozil-aglikont az alábbiak szerint további tisztításnak vetjük alá: a vizes fázist In nátrium-hidroxiddal semlegesítjük, majd vákuumban kb. 18 ml-re töményitjük be. A kapott oldatot kétszer egymás után kromatográfiás futtatásnak vetjük alá saválló acél oszlopban (átmérő 2 cm), amelyet 20 g 10 mikronos RP 18 szilikagéllel töltöttünk meg (Lichroserb RP18 Merck Co., art. 9334); a töltetet 17:83 (térf./térf.) acetonitril: 18 mmólos pH 6,0 nátrium-foszfát puffer oldószereleggyel egyensúlyozzuk ki. Az oszlop része egy Chromatospac Modulprep egységnek (Joben Yvon, Longjumeau, Franciaország). Az oszlopot 17:83 acetonitril: 18 mmólos pH 6,0 nátrium-foszfát puffer eleggyel eluáljuk. Az eluált frakciókat 275 nm-en vizsgáljuk, UVICORD S UV monitor (LKB Co.) alkalmazásával, és a meghatározást HPLC és TLC technikával végezzük. Az A 40926 antibiotikum raannozil-aglikont tartalmazó, a két kromatográfiás futtatással kapott frakciókat összeöntjük és a szerves oldószer eltávolítására vákuumban betöményítjük. A kapott vizes oldatot ezután kromatografáljuk és feldolgozzuk (az 1. b) példában leírtak szerint); így 66 mg A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon liofilizátumot kapunk. A kiindulási anyagok előállítása 1. művelet Fermentáció az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel Egy A 40926 antibiotikumot termelő törzs (Ac ti nőimül ura sp. ATCC 39727) tenyészetét zabliszt ferde agaron 2-3 héten át 28 °C-on tenyésztjük és ezt használjuk fel egy 500 ml-es Erlenmeyer lombik beoltására, amely 100 ml, következő összetételű táptalajt tartalmaz: 0,5% húskivonat 0,5% autolizált élesztő 0,5% pepton 0,3% hidrolizált kazein 2% glukóz 0,13% NaCl pH sterilizálás előtt 7,5. A lombikot 28 °C-on kb. 72 órán át 200 ford./perc sebességű forgó rézógépen inkubáljuk, majd a tenyészetet átvisBzük egy fermentorba, amely 4 liter előbbi összetételű táptalajt tartalmaz. Ezt a tenyészetet 28 °C-on kb. 72 órán át tenyésztjük, kb. 2 liter/ /perc sebességű levegó-ótfuvatással és kb. 900 ford./perc sebességgel való keveréssel. Egy ilyen lombikot használunk el egy 200 literes, ugyanilyen táptalajt tartalmazó férmentor beoltására. Ezt a fermentort 100 liter/perc mennyiségű steril levegővel levegőztetjük és kb. 28 °C-on 250 ford./perc sebességgel keverjük. Az antibiotikum termelést papírkorongos agar-diffúziós módszerrel követjük, minimális táptalajon, teszt-organizmusként B. subtilist alkalmazva. A maximális aktivitást 72-96 óra elteltével érjük el. 2. művelet Az A 40926 antibiotikum kinyerése A) A fermentlevet 4 °C-ra hűtjük, pH 9,5-re állítjuk be és keverjük. Kb. 1 óra elteltével szűrjük és a szűrlet pH-ját vizes ásványi savval kb. 3,5-re állítjuk be. Az elegyet 4 °C-on 30 percen át keverjük, majd Hyflo-FloMaE szűrést elősegítő anyaggal szűrjük. A tiszta szűrletet eltávolítjuk; a szűrölepónyt ionmentesitett vizben szuszpendáljuk, a szuszpenzió pH-ját kb. 8,5-re állítjuk be, keverjük, majd szűrjük. A kinyert szűrölepényt ugyanennek az eljárásnak vetjük alá. Az egyesített szűrletek tartalmazzák az A 40926 antibiotikumot. B) 2 liter duzzasztott D-Ala-D-Ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose módosított mátrixot adunk az 1. művelet szerint előállított fermentléhez (miután szűrtük éB a tiszta szűrlet pH-ját kb. 8,5-e állítottuk be), vagy az előbbi 2.A) eljárás szerint kapott egyesített szűrlethez. Egy éjjelen ét szobahőmérsékleten való keverés után a gyantát szűréssel kinyerjük és egymás után a következőkkel mossuk: kb. 2 x 10 liter pH 7,5 0,45 mmólos HC1-TRIS puffer (TRIS = 2-amino-2-hidroxi-metil-l,3-propándiol), amely 5 tömeg/térf.% NaCl-t tartalmaz, majd 4 x 20 liter desztillált víz. Az A 40926 antibiotikumot 2 x 20 liter 1 tömeg/térf.%-os ammónium-hidroxiddal eluáljuk u gyantáról. Az eluátumokat egy éjjelen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd kis térfogatra (kb. 2,5 liter) betöményítjük. A vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval távolitjuk el. Ezután petrolétert adagolunk; így 3,4 g nyers A 40926 antibiotikum komplexet csapunk ki. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
