201099. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 40926 antibiotikum mannozil-aglikon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 HU 201099 B 6 Jellegzetes példák a poláris, vizzel elegyedő oldószerekre: vizoldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, alkánkarbonsavak rövid szénláncú alkil-észterei (pl. az etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán, dimetil-formamid és ezek elegyei. A leginkább kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer az acetonitril. Az eluált frakciók antibiotikum-tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok segítségével határozzuk meg, amilyen pl. a papirkorongos vagy az agardiffúziós meghatározás, érzékeny mikroorganizmusok alkalmazásával. Az érzékeny organizmusokra példa a Bacilus subtilis és a S. aureus. A tisztítást, akárcsak a reakciót, ugyancsak előnyösen TLC vagy HPLC technikával követhetjük. Kitüntetett HPLC technika az olyan fordított fázisú HPLC eljárás, amelynek keretében 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált szilanizált szilikagélból előállított, előnyösen 5 mikrométer átmérőjű porózus, gömb alakú részecskékkel töltött oszlopot alkalmazunk (ilyen pl. az 5 /um-es Ultrasphere" ODS Altex, Beckman Co. töltetű oszlop). Az eló-oszlop 18 szénatomos alkil-csoportokkal funkcionalizált szilikagél töltetet tartalmaz (amilyen pl. az RP 18, Brownlee Labs); eluálószerként pedig egy poláris, vízzel elegyedő oldószer (pl. az előbbiekben leírtak közül) lineáris gradiens elegyét alkalmazzuk egy vizes pufferoldattal. Ezt az oldatot előnyösen pH 5-7-re állítjuk be. A leginkább kitüntetett oldószer a B eluálószer 5-60%-os lineáris gradiense A eluálószerben, ahol az A eluálószer acetonitril és egy pH 5-7 vizes puffer 10:90 elegye és a B eluálószer acetonitril és egy pH 5-7 vizes puffer 70:30 arányú elegye. Mint ez a szakember számára ismert, belső standardként számos anyag alkalmazható. Ebben az esetben nagyon előnyös az L 17054 antibiotikum, amelynek retenciós ideje ebben a HPLC rendszerben közel áll a találmány szerinti vegyületekéihez. Ez a standard anyag ismert; a 0 119 575 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés Írja le. A találmány szerinti vegyületek antibakteriális aktivitása in vitro a szokásos higitási tesztek segítségével mutatható ki, különböző mikroorganizmus tenyészetek alkalmazásával. A MIC (minimális gátló koncentráció) értékek meghatározásához a következő táptalajokat és tenyésztési körülményeket használtuk fel: Isosensitest leves (Oxoid), 24 óra, a staphylococcusok esetében, valamint a Strep, faecalis és a Gram-negatív baktériumok (Escherichia coli) esetében; Tedd-Hewitt leves (Difco), 24 óra a többi streptococcus-féleség esetében; GC alapleves (Difeo) + IX Isovitalex (BBL), 48 óra, COz-ban dúsított atmoszféra a Neisseria gonorrhoeae esetében; GB alap-agar (Difco) + IX Isovitalex + 0,001% hemin, 24 óra a Haemephilus influenzae esetében; AC leves (Difco), 24 óra, anaerób atmoszféra a Clostridium perfringens esetében; Wilkins-Chalgren agar (T. D. Wilkins, S. Chalgren, 1976, Antimierob. Ag. Chemother. 10, 926), 48 óra, anaerób atmoszféra a többi anaerób (C. diffieile, - Propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis) esetében; PPLO leves (Difco) + 10X lószérum + IX glukóz, 48 óra a Mycoplasma galiseptieum esetében. Az inkubálást 37 °C-on végezzük. Az inokulumok a következők: 1 térf./térf.X 48 órás leves-tenyészet a M. galiseptieum esetében; kb. ÍO^IO5 telepképző egység/ml a többi leves-higitásos MIC meghatározás esetében; kb. 10*-105 baktérium/ /folt (többpontos inokulátorral inokulálva) az agar-higitásos MIC meghatározások esetében (H. influenzae, C. diffieile, P. acnes, B. fragilis). A következő I. táblázatban mutatjuk be a különböző mikroorganizmusokra vonatkozó minimális gátló koncentrációkat (MIC, jug/ml). I. táblázat Törzs A 40926 antibiotikum mannozil-aglikon, MIC (ug/ml) Staph, aureus Teur 0.25 Staph, aureus Teur (L165) 106 telepképző egység/ml 1 Staph, aureus Teur 30X szarvasmarha szérum 2 Staph, epidermidis ATCC 12228 0.5 Strep, pyogenes C203 1 Strep, pneumoniae UC41 1 Strep, faecalis ATCC 7080 1 Strept. mitis klinikai izolátum 1 Clostridium perfringens ISS30543 0.13 Clostridium diffieile ATCC 9689 2 Bacteroides fragilis ATCC 23745 64 Propionibacterium aenes ATCC 6919 1 Neisseria gonorrhoeae ISM68/126 32 Haemophilus influenzae b tipus ATCC 19418 64 Escherichia coli SKF 12140 128 felett Mycoplasma galliseptieum S6 Weybridge 128 felett A találmány szerinti vegyületek antimikrobiális aktivitását in vitro kísérletekkel íb megerősítettük, amelyeket lényegében a R. Pallanza et al. által leirt módon [J. Antimierob. Chemother. 11, 419 (1983)] végeztünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
