201098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűrűs peptidek, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 201098 B 12 sal állítjuk eló. A példákban a peptidek jellemzését és tisztaságuk meghatározását aminosav-analízis, analitikai HPLC, UV, IR és MS segítségével végezzük el. 1. példa Ac-Tyr(S03H)-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metil- J___________________I -Phe-NH2 előállítása 5 g (17,8 millimól) Boc-N-metil-Phe-t 50 ml metilén-klorid és 50 ml dimetil-formaraid 0 °C-ra hűtött elegyében oldunk, majd keverés közben 1,8 g (9 millimól) diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá és az elegyet 60 percen át 0 °C-on keverjük. Másik lombikban 5 g benzilhidril-amin-gyantét (0,56 millimól N/g: sztirol és IX divinil-benzol térhálósított kopolimerje) 10X diizopropil-etil-amint tartalmazó metilén-kloriddal 30 percen ét mossuk, majd szűrjük és metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal és metilén-kloriddal mossuk. A lehűtött elegyet a gyantához adjuk és 24 órán ét szobahőmérsékleten keverjük. A gyantát szűrjük, metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal, izopropanollal, metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal, izopropanollal és metilén-kloriddal mossuk, majd nagyvákuumban szárítjuk. A gyanta aminosav-analízis szerint 0,20 millimól N-metil-fenil-alanint/g gyanta tartalmaz. A reagálatlan aminocsoportokat oly módon fogjuk be, hogy a gyantát 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml diizopropil-etil-amin raetilén-kloridos oldatával 60 percen ét rázatjuk. A gyantát szűrjük és metilén-kloriddal, izopropanollal dimetil-formamiddal és metilén-kloriddal mossuk. 4,8 g (0,96 millimól) Boc-N-metil-fenil-alanin gyantát az alábbiakban ismertetésre kerülő eljárás szerint szekvenciális szilérdfázisú szintézisnek vetjük alá. Az összes kapcsolást a Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeinek felhasználáséval, a leírt módon végezzük el. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat az alábbi megfelelő reakcióidőkkel adagoljuk: hat különálló ciklust végzünk, éspedig Boc-aszparaginsav-ű-benzil-észterrel (1,6 g 5 millimól, 60 perc; 1,6 g 5 millimól, 60 perc); Boc-metioninnal (1,25 g, 5 millimól, 30 perc; 1,25 g 30 perc, 5 millimól); Boc-N’-formil-triptofánnal (1,70 g, 5 millimól, 30 perc; 1,70 g, 5 millimól, 30 perc); Boc-glicinnel (900 mg, 5 millimól, 30 perc, 900 mg, 5 millimól, 30 perc); Boc-E-2- -klór-Z-lizinnel (2,10 g, 5 millimól, 30 perc; 2,10 g, 5 millimól, 30 perc) és Boc-2,6-diklór-benzil-tirozinnal (2,2 g 5 millimól, 30 perc; 2,2 g, 5 millimól, 30 perc). A Boc-védőcsoportok lehasítása és a gyanta 20 ml ecetsavanhidriddel 20 ml piridinben és metilén-klorid ban végzett acetilezése után 5,2 g acetilezett heptapeptidil-gyantát kapunk. 1,9 g peptidil-gyantát - 2 ml dimetil-szulfidot, 1 ml anizolt és 0,7 ml ditioetánt tartalmazó - 25 ml hidrogén-fluoriddal egy órán át 0 °C-on végzett kezeléssel hasítunk. Az elegyet alaposan bepéroljuk, a gyantát 2 térfogat etil-acetáttal mossuk, majd 4x15 ml 30%-os ecetsavval titráljuk, szűrjük és liofilizáljuk. 300 mg nyers peptidet kapunk. 150 mg nyers peptidet preparativ HPLC segítségével mikro Bondapack Cis oszlopon (2,3x30 cm) tisztítunk. A peptidet 5-65%-os lineáris grádiens szerint 0,022X TFA/CHsCN elegyekkel eluáljuk; átfolyási sebesség 8 ml/perc. A kimutatást 280 nm-nél végezzük. A főcsúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 20 mg (11%) Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metil-Phe-NHz-t kapunk. A kapott termék HPLC szerint homogén és a megfelelő arainosav-analizist és MS-t adja. 19 mg (0,02 mól) lineáris peptidet 1 ml dimetil-formamidban oldunk és 0,1 ml 3 mólos sósavas dioxánt adunk hozzá. A reakcióelegyet szárazra pároljuk és a maradékot 1 ml DMF-ben oldjuk. Ezután 0,13 ml (0,005 millimól) difenil-foszforil-azidot adunk hozzá, majd az elegyet -20 °C-ra hűtjük és egy órán át -20 °C-on keverjük. A reakcióelegyet 15 ml DMF-al hígítjuk, majd a pH-t N-metil-morfinnal 7,5-re állítjuk be (megnedvesített pH papírcsíkkal mérjük). A reakcióelegyet 5 °C-ra hagyjuk felmelegedni, majd ezen a hőmérsékleten pH=7,4 értéken két napon át állni hagyjuk. A pH-t N-metil-morfolin kis aliquot részeinek hozzáadáséval ezen az értéken tartjuk. A reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot 1 ml ecetsavban oldjuk és mikro Bondapack Cis oszlopra (2,3x30 cm) visszük fel. Az oszlopot 5-65%-os lassú gradiens szerint (4 óra) 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel eluáljuk, 8,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A kimutatást 280 nm-nél végezzük el. A frakciókat 3 perces időközökben gyűjtjük össze és a vágásokat analitikai HPLC meghatározás után végezzük. A gyűrűs peptidnek megfelelő csúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 8 mg (45%) Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-NJ_________________I-metil-Phe-NH2 képletű terméket kapunk. A fenti termék HPLC szerint homogén és az alábbi aminosav-analízist adja: Asp 1,00 (1); Gly 1,07 (1); Met 1,00 (1); Tyr 1,12 (1); Lys 1,00 (1); a Trp-t és N-metil-Phe-t nem határozzuk meg; a termék a várt MS-t mutatja. Összegképlet: C49H62N10O10S, molekulatömeg 982,14. 190 mg piridin-acetil-szulfáthoz (PÁS) 10 ml frissen desztillált piridint adunk. A kapott elegyet 60 °C-on keverés közben 10 percen át melegítjük. Az oldatot hűlni hagyjuk, majd 8,0 mg Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met-1_______________-Asp-N-metil-Phe 10 ml piridinnel képezett 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
