201098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűrűs peptidek, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

13

HU 201098 B

14

oldatét adjuk hozzá. A reakcióelegyet egy órán ét 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük és liofilizáljuk. A tisztítást fordított fázisú preparativ HPLC segítségével ES Industries Cis-10 u oszlopon (1,25x30 cm) végezzük el, 0,05 mólos NH4HCO3/CH3CN elegyekkel 10- -40%-os lineáris gradiens szerint, 5 ml/perc átfolyási sebesség mellett; a kimutatást 240 nm-nél végezzük el.

7,0 mg (87%)

Ac-Tyr(S03H)-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metil- 1_________________1

Phe-NH2-t kapunk.

Aminosav-analizis: Asp 1,00 (1); Gly 1,00 (1); Met 1,00 (1); Tyr 1,12 (1); Lys 1,00 (1); Trp-t és N-metil-Phe-t nem határoztuk meg. Összegképlet: C49H62NioOi3S2, molekulatömeg 1063,21.

UV-adatok: 0,1 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxidban

X váll 272 nm E = 5260

X max 280 nm £ = 5530

X max 288 nm £ = 4750

IR-adatok: kálium-bromidban 3325 cm-1: OH, NH 1655 cm*1: amid, karbonil 1530 cm*1: amid II 1505 cm*1: tirozin 1200 cm*1: szulfát

2. példa

Tyr(S03H)-Met-Glu-Trp-Met-Thr(S03H)-N-me- J______________I

til-Phe-NH2 előállítása

4,0 mg (0,8 millimól), az 1. példában leirt módon készített Boc-N-metil-fenil-alanin gyantát az 1. példában ismertetett szekvenciális szilérdfázisú szintézisnek vetünk alá. Az összes kapcsolást a korábbiakban leírt Boc-aminosav vegyes anhidridek felhasználásával végezzük el. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat az alábbi megfelelő reakcióidőkkel adagoljuk: hat különálló ciklust végzünk, éspedig Boc-O-benzil-treoninnal (1,5 g, 5 millimól, 60 perc; 1,5 mg, 5 millimól, 60 perc); Boc-metioninnal (1,25 g 5 millimól 30 perc; 1,25 g, 5 millimól, 30 perc); Boc-N1- -formil-triptofánnal (1,7 g 5 millimól, 30 perc;

1,7 g, 5 millimól, 30 perc); Boc-glutarainsav-Tj-benzil-észterrel (1,6 g, 5 millimól, 30 perc; 1,6 mg, 5 millimól, 30 perc); Boc-metioninnal (1,25 g, 5 millimól, 30 perc; 1,25 mg, 5 millimól, 30 perc) és Boc-2,6-diklór-benzil-tirozinnal (2,2 g, 5 millimól, 30 perc; 2,2 g, 50 millimól, 30 perc). A Boc-védöcsoportok eltávolítását az 1. példában leírt módon hajtjuk végre; 4,9 g heptapeptidil-gyantát kapunk.

1 g gyantát - 12 ml dimetil-szulfidot,

2,0 ml p-krezolt és 1 ml ditio-etánt tartalmazó-hidrogén-fluoriddal (5 ml) történő kezeléssel hasítunk. Az elegyet kis térfogatra pároljuk be, majd a reakcióedénybe 18 ml friss vízmentes hidrogén-fluoridot desztillálunk be és ezt a második kezelést 2 órán át 0 °C-on végezzük. Az elegyet alaposan bepároljuk, a gyantát etil-acetáttal mossuk, majd 30%-os ecetsavval titráljuk, szűrjük és liofilizáljuk. 210 mg nyers peptidet kapunk. 100 mg fenti nyers peptidet preparativ HPLC segítségével mikro Bondapack Cis oszlopon (2,3x30 cm) tisztítunk. A peptidet 5-65%-os lineáris gradiens szerint 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel eluáljuk, 8 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A kimutatást (detektálást) 280 nm-nél végezzük el. A föcsúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 15 mg (19%) Tyr-Met-Glu-Trp-Met-Thr-N-metil-Phe-NH2-t kapunk. A termék HPLC szerint homogén és a kívánt aminosav-analizist és MS-t adja.

15 mg (0,02 mól) lineáris peptidet az 1. példában ismertetett módon difenil-foszforil-azid felhasználásával ciklizálunk.

6 mg (41%) Tyr-Met-Glu-Trp-Met-Thr-N-me- 1________1

til-Phe-NHz-t kapunk. A termék HPLC szerint homogén és aminosav-analizise a következő: Thr 0,90 (1); Glu 1,00 (1); Met 2,00 (2); Tyr.

1,00 (1); Trp 0,80 (1); az N-metil-Phe-t nem határoztuk meg. A termék a kívánt MS-el rendelkezik.

Összegképlet: C49H63N9O10S2, molekulatömeg

1002,0.

80 mg piridin-acetil-szulfáthoz (PÁS) 6 ml vízmentes desztillált piridint adunk. A kapott elegyet 60 °C-on 10 percen át keverés közben melegítjük. Az oldatot lehűlni hagyjuk, majd 3 mg Tyr-Met-Glu-Trp-Met- 1-------------1

Thr-N-metil-Phe-NH2 3 ml pirídinnel képezett oldatét adjuk hozzá. A reakcióelegyet egy órán át 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük és liofilizáljuk. A tisztítást preparativ fordított fázisú HPLC módszerrel, ES-Industries C18-IO aj oszlopon (1,25x30 cm) 10-40%-os lineáris gradiens szerint 0,05 NH4HCO3/CH3CN elegyekkel, 120 percen át, 5 ml/perc átfolyási sebességgel végezzük el. A kimutatás 240 nm-nél történik. Kitermelés 1,4 mg (45%) Tyr(S03H)-Met-Glu-Trp-Met-Thr(S03H)-N-me- 1----------------------1

til-Phe-NH2

Aminosav-analizis: Thr 0,85 (1); Glu 1,00; (1); Met 1,80 (2); Tyr 1,00 (1); Trp 0,75 (1); N-metil-Phe-t nem határoztuk meg. Összegképlet: C49H63N9O18S4, molekulatömeg 1162,32.

UV-adatok: 0,11 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxidban

X váll 272/273 nm £ 4660 X váll 280 nm £ 4760

X váll 289 nm £ 4055

IR-adatok: kálim-bromidban 3400 cm*1: OH, NH 1675 cm*1: amid, karbonil

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9