201096. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok kristályszuszpenziójának és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására
1 HU 201096 B 2 A találmány tárgya eljárás inzulinszármazékok új kristályszuszpenziójának és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására. Az inzulin kristályosítása mind szerkezetvizsgálati módszerek [Adams és munkatársail Nature 224, 491 (1961), The Peking Insulin Structure Research Goup, Sc. Sinica XVII, 152-118 (1974)], mind gyógyszerkészítményként való felhasználás [Schlichtkrull, Insulin-Kristalle (1961)] szempontjából fokozottan kutatott terület. Az inzulin lassitottan felszívódó formájának terápiás alkalmazásához előnyös, ha az inzulin lehetőleg meghatározott kristályméretű, amely a kb. 30 pm-t nem haladhatja meg, és így a kristály felület az inzulinmennyiséggel reprodukálható módon öszszefüggésben van. Ezzel az úgy nevezett monodiszperz szuszpenzióval kapcsolatban meghatározott újrafeloldódási kinetika várható. Ilyen tulajdonságokkal rendelkező, terápiásán alkalmazott inzulinkristály-szuszpenziók például az olyan szuszpenziók, amelyek kb. 25 um méretű romboéder cink-inzulin-kristályokból állnak és amelyek 0,8-2,5% cink jelenlétében semleges pH-nál stabilak, és lassított hatást mutatnak, valamint az Isophan-inzulin-protamin-kristályok, amelyek 10 um hosszú és kb. 1 um vastagságú pálcikák formájában lassított felszivódású készítmények formájában állnak rendelkezésre. Ezenkívül vannak az inzulinnak további ismert kristálymódosulatai, amelyek eddig csak a röntgen-szerkezetvizsgálat szempontjából voltak érdekesek. így savas pH-nál cinkmentes ortoromboid és monoklin kristályok nyerhetők [Einstein, Low, Acta Cryst. 15, 32-34 (1962)]. Az izoelektromos pontnál, hasonlóképpen cink távollétében kisebb rombododekaéderek nyerhetők, amelyek kubusokba rendeződnek [Schlichtkrull, Insulin-Kristalle (1961)]. Végül Schlichtkrull az inzulinnak még egy monoklin kristályformáját ismerteti, amely izoelektromos pont fölött cink és fenol vagy fenol-származékok jelenlétében nyerhető. Ezek a kristályok néhány nap alatt nőnek megfigyelhető méretűre (3 mm-ig) és éles szélekkel rendelkeznek. Érdekes módon ezek a kristályok csak az üveg felületén találhatók, az oldat szabad felületén nem [Schlichkrull, Insulin-Kristalle, S. 57-60 (1961)]. A különböző kristályosítási módszerekkel kapott inzulinok és proinzulinok összehasonlításakor azoknál az inzulinszármazékoknál, amelyek legalább egy pozitív töltéssel rendelkeznek, az tapasztalható, hogy izoelektromos pontjuk magasabb pH-értékek felé tolódik el. Ide számítanak különösen azok a származékok, amelyek a B-lánc C-terminális végén egy bázikus csoportot tartalmaznak, mint például az ismert pankreáz-extraktumban kis mennyiségben található proinzulin lebontási termék, az inzulin-ArgB31-OH és az inzulin-ArgB31-Arg32-OH. Más hasonló tulajdonságú származékok felszintetikus utón nyerhetők. Ilyen inzulin-származékokat, előállítási eljárásukat, valamint alkalmazásukat írja le a P 33 26 672.4 és a P 33 26 473.2 sz. 5 NSZK szabadalmi bejelentés. Ezek például az arginin helyén vagy ahhoz kapcsolódva más bázikus aminosavakat vagy bázikus aminosavszármazékokat (például D-aminosavakat, ornitint, hidroxi-lizint, argi- 10 ninolt) vagy egyszerű alkoholokkal vagy aminokkal alkotott észter- vagy amid-származékokat tartalmaznak a C-terminális végen. Itt az alkohol vagy az amid még egy pozitív töltést vihet a molekulába, mint pldául az 15 inzulin-(B30)-kolinészterben. Kísérleteink során meglepő módon azt találtuk, hogy ezek a származékok izoelektromos pontjuk közelében vizes közegből, aromás hidroxi-vegyület jelenlétében nagyon 20 egyenletes formájú, mintegy 10 um méretű prizmák formájában kristályosodnak. A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletü inzulin-származékok kristályszuszpenziójának előállítására. Az (1) általá- 25 nos képletben R1 jelentése L-H-Phe, R30 jelentése L-Ala vagy L-Thr, R31 jelentése D- és/vagy L-konfigurációjú, Arg és/vagy Lys, amelyeknek a láncvégi 30 karboxilcsoportja szabadon vagy 1-4 szénatomos alifás alkohollal észterezett formában lehet jelen, vagy kolinészter-származéka. A találmány értelmében úgy járunk el, 35 hogy a kristályosítást vizes közegben, az izoelektromos pontnak megfelelő ±1 pH-értéken fenol és/vagy m-krezol legfeljebb 3 mg/ml, előnyösen 1,5-2,5 mg/ml mennyisége és kívánt esetben az inzulin tömegére szá- 40 mítva 1% cink és izotóniát biztosító anyag jelenlétében, 3 és 27 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Előnyösek azok a peptidek, amelyekben R31 aminosavészter csoportot jelent L-formá- 45 ban. Az (1) általános képletü peptidek közül különösen azok fontosak, amelyeknek a C-terminális végén egy karboxilcsoportot blokkoló csoport található, ez 1-4 szénatomos 50 alkoxicsoport. Az (I) általános képletü inzulin-származékok különösen a humán- vagy sertés-inzulin szekvenciájának felelnek meg. A találmány szerinti eljárással például a 55 következő inzulin-származékok kristályszuszpenziója állítható elő: humán inzulin-Arg31-OH sertés inzulin-ArgB31-OH sertés inzulin-ArgB31-OCH3 60 humán inzulin-ArgB31-OCH3 sertés inzulin-ArgB3l-ArgB32-OCH3 humán inzulin-Arg^^Arg^^OCHs humán inzulin-LysB31-OH humán inzulin-D-ArgB31-OH 65 humán inzulin-D-ArgB31-ArgB32-OH 3
