201096. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok kristályszuszpenziójának és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására
3 HU 201096 B 4 humán inzulin-ArgB3l-D-ArgB32-OH humán inzulin-LysB31-ArgB32-OH humán inzulin-ArgB31-LysB32-OH Az (1) általános képletü inzulinszármazékokat úgy állítjuk elő, hogy a) egy (II) általános képletü oktapeptid-(B23-30)-inzulint - ahol Rl jelentése hidrogénatom vagy egy kötés, és S1 jelentése protonszolvolitikusan vagy eliminációval lehasitható aminovédőcsoport, például terc-butil-oxi-karbonil-(Boc), terc-amil-oxi-karbonil-(Aoc) vagy metil-szulfonil-etil-oxi-karbonil-( Mse (-csoport- egy (III) általános képletü pepiiddel H-Gly-Phe-Phe-Tyr(S2)-Thr(S2)-Pro-LysfS^-R^-R31 (III) - ahol R30 és R31 jelentése a fenti, S2 jelentése hidrogénatom, benzil- vagy terc-butil-csoport, S3 jelentése uretán-védöcsoport, például Boc, Moc, Fmoc vagy Z, és az R30 és R31 csoportokban adott esetben jelenlévő szabad karboxil-, hidroxil-, tio-, w-amino-, guanidino- és/vagy imidazolcsoportok szükség esetén védett alakban vannak jelen - kondenzáljuk, és az adott esetben jelenlévő védőcsoportokat ismert módon eltávolítjuk; b) egy (I) általános képletü Des-B30-Inzulin-származékot - ahol R1 jelentése hidrogén vagy H-Phe és a C-terminális RiW-R31 együttesen hidroxilcsoportot jelent - tripszin vagy tripszinhez hasonló endopeptidá'z jelenlétében egy (IV) általános képletü vegyülettel H-R^-R31 (IV)- ahol R30 és R31 jelentése a fenti, és ahol a szabad karboxil-, hidroxil-, tio-, w-amino-, guanidino- és/vagy imidazol-csoportok kívánt esetben védett formában vannak jelen - reagáltatjuk, és az adott esetben jelenlévő védöcsoportokat ismert módon eltávolítjuk; vagy c) egy az R31 csoportban L-konfigurációjú aminosavakat tartalmazó inzulin-származék előállításéra egy proinzulint, proinzulin-származékot, preproinzulint vagy preproinzulin-származékot vagy ezek intermedierjét kémiai és/vagy enzimatikus úton hasítunk. A kiindulási Des-PheB31-inzulinok ismertek például a 20 05 658 sz. NSZK szabadalmi leírásból vagy a 46 979 sz. európai közrebocsátósi iratból. A b) eljárásban kiindulási anyagként használt Des-B30-inzulinok ismertek például a 46 979 sz. európai közrebocsátási iratból vagy a Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 359, (1978) 799 irodalmi helyről. A b) eljárásban kiindulási anyagként használt (IV) általános képletü vegyületek a peptidkémiában ismert módon állíthatók elő. A (IV) általános képletü vegyületnél használható védöcsoportokat ismertet M. Bodanzky és munkatársai, Peptide Synthesis, Ind. Ed. 1976, Wiley and Sons. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható, tripszinhez hasonló endopeptidázo- 5 kát ismertet például a 89 007 számú európai szabadalmi leírás. Ezek olyan enzimek, amelyek peptidkötéseket a karboxilvégi bázikus aminosavaknál specifikusan hasítanak. Egy előnyös tripszinhez hasonló endopeptidáz 10 például a lizil-endopeptidáz. A c) eljáráshoz géntechnológiai úton előállított humán-, illetve fóemlös-proinzulin áll rendelkezésre. Ebből az Arg(B31) és a di-Arg(B31-32) egyszerű tripszines vagy trip- 15 színhez hasonló enzimmel végzett emésztéssel nyerhető. Emellett viszonylag egyszerűen állíthatók elő olyan plazmidok, amelyek a megfelelő prepoinzulinszármazékok hasításával új inzulinszármazékokat eredményeznek, mert 20 ezek a természetes körülmények között a B31 vagy B32 helyen található arginin helyén más semleges vagy bázikus aminosavakat kódolnak. A proinzulin rekombináns-DNS-techniká- 25 val történő előállítása egy olyan proinzulin-amiosav szekvenciához tartozó DNS-szekvenciájának létrehozását teszi szükségessé, amely izolálással, felépítéssel vagy ezek kombinációjával érhető el. A proinzulin-DNS-t 30 ezután leolvasási fázisban egy alkalmas klónozó vagy kifejezővektorba beiktatjuk. A kapott hordozóvektort az alkalmas mikroorganizmus transzformálására használjuk, és az így kapott transzformált mikroorganizmust 35 azután fermentációs úton szaporítjuk, így a proinzulint tartalmazó vektor további másolatát és a proinzulin, tiszta inzulin-származék, preproinzulin, illetve preproinzulin-származék kifejezését lehet elérni. 40 Ha a kifejezési terméknél egy preproinzulinról van szó, akkor ez a termék általában azzal a proinzulinszekvenciával rendelkezik, amelynek végső aminocsoportja egy proteindarabhoz van kapcsolva, amely normál eset- 45 ben azzal a génszekvenciával fejeződik ki, amelynél a proinzulint vagy a proinzulinszármazékot kódoló szekvenciát beiktattuk. A proinzulin-amiosavszekvencia a proteindarabbal egy specifikusan hasítható helyen van 50 megkötve, ez például metionin lehet. A kapott proinzulin-aminosavszekvenciát a kapcsolódó génterméktől lehasítjuk, például úgy, ahogyan a 32 32036 sz. NSZK közrebocsátási iratban le van írva, majd a proinzulint tisz- 55 ti tás után izoláljuk. A találmány szerinti eljárásban a kristályosító közeg tartalmazhat cinket is, a cinkmennyiség előnyösen legfeljebb 1%, különösen 0,8% lehet, az inzulinszármazék tömegére 60 számítva. A kristályosításhoz általában elég, ha viszonylag csekély cinket használunk, maximum 40 ug/100 egység, előnyösen 30 pg/100 egység, ahol az egységek szárazanyagtartalomra vonatkoznak. 65 4
