201093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére
11 HU 201093 B 12 10 mól/liter közti karbamidot tartalmazó vizes oldatokban közel semleges pH-n. Egy lényegében tiszta fénytörő testecske preparátum viszonylag kis mennyiségének csak részleges szolubilizálását érjük el karbamiddal közel semleges pH-n rövid időn belül. Ahogy a karbamid koncentráció csökken, a szolubilizálás mértéke is csökken. Ahogy a karbamid-koncentráció jóval 8 mól/liter alá kerül, közel semleges pH-n csak kis szolubilizálás észlelhető. A hidrofób fehérjék általában csökkentett hőmérsékleten oldhatóbbak vizes oldatban. A jelen találmány szempontjából is ügy találtuk, hogy a szomatotropin-jellegű fehérjék szolubilizálása karbamiddal nagyobb mértékű csökkentett hőmérsékleten, tipikusan 4 °C hőmérsékleten, mint szobahőmérsékleten, tipikusan 20-25 °C hőmérsékleten. A nagyobb oldhatóságon túl a csökkentett hőmérsékleten végzett szolubilizálás a karbamidos oldat megnövekedett stabilitását és a proteáz aktivitás gátlását is eredményezi, amely proteáz-aktivitás jelen lehet a fénytörö testecske készítményben. Bár a fentebb leirt előnyös hatásokról bemutatjuk, hogy eredményesek, a műveleteket csökkentett hőmérsékleten végezve, a műveleti hőmérséklet nem kritikus a jelen találmány szempontjából. Lehet alkalmazni más hőmérsékleteket is, amíg a fehérje nem denaturálódik irreverzibilisen. Legtöbb esetben azonban elvárható, hogy a hőmérséklet 25 °C alatt, de az oldat fagyáspontja fölött legyen, ez a legelőnyösebb, ezért ezt célszerű alkalmazni. A jelen találmányban szomatotropin fehérje szignifikáns mennyiségének szolubilizólásót valósítjuk meg vizes karbamidoldat pH-jának növelésével vagy csökkentésével. Bár az oldat pH-ja beállításának nem várt hatása a savasabb vagy lúgosabb pH felé nyilvánvalóvá válik az ez utón következő példákból, az alkálikus pH beállítása az előnyösebb, mivel a helyreállítási lépés, pontosabban a redukált monomer oxidálása, bázissal katalizált. Az oldat pH-ját alkalikusabbá lehet tenni megfelelő bázis, mint pl. nátrium-hidroxid, hozzáadásával. Ahogy a fénytörő testecskék oldódnak, az oldat pH-ja csökkenhet, több bázis időszakos hozzáadását igényelve, hogy az alkalikus körülményeket fenntartsuk. A fénytörö testecskék teljesen szolubilizálódnak 60 mg/ml vagy nagyobb koncentrációknál. Ezen felül a szolubilizálást el lehet érni akár 1,0 mól/liter karbamid-koncentrációnál is. Az igényelt szolubilizálási körülmények (azaz karbamid-koncentráció, az alkalmazott karbamid-oldat mennyisége a fénytörö testecskék mennyiségéhez viszonyítva, az oldat pH-ja) függ a szóban forgó fénytörő testecske öszszetételétől és a szolubilizálandó fénytörö testecskék mennyiségétől. Bár a jelen találmány szempontjából nem kritikus, alkalmazhatunk megfelelő, kölcsönhatásba nem lépő pufferoló szereket, hogy segítsük az oldatban a pH csökkenést jelentő változásokat a szolubilizálási lépések során. A megfelelő pufferoló szerek lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) pl. a következők: Trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán és etanol-amin. A trisz (hidroxi-metil)-amino-metán, amelyet a továbbiakban trisz-nek nevezünk, előnyös, mivel olcsó és könnyen rendelkezésre áll. A trisz koncentrációja 10 és 90 mmól/liter között úgy tűnik, hogy szignifikánsan nem befolyásolja a szomatotropin kitermelését. Egy frissen készített 50 mmól/literes trisz-oldat pH-ja mintegy 11,5. A trisz azonban, 4 °C hőmérsékleten 8,8 pK-val, csupán gyenge pufferoló kapacitással rendelkezik ennél a magas pH-nál. 40 és 60 mmól/liter közti trisz-koncentráció előnyös, hogy minimumra csökkentsük a trisz-felhasználást, miközben mégis fenntartunk bizonyos pufferoló kapacitást. Ha a szomatotropin a fénytörő testecskékben aggregált és/vagy oxidált formában van jelen, előnyös exogén redukálószert, pl. ß-merkapto-etanolt vagy 1,4-ditio-treitolt alkalmazni a vizes karbamid-oldatban, hogy megelőzzük az intramolekuláris és intermolekuláris diszulfid-kötések hasadását. Ha ilyen nem megfelelően .göngyölt' monomer vagy aggregált szomatotropin van jelen, redukáló ágens jelenléte tipikusan növeli a biológiailag aktív szomatotropin kinyerését. Úgy találtuk, hogy a redukáló ágens és a szulfhidril csoportok együtt oxidálódhatnak a karbamid-oldatban, jó kitermeléssel adva a korrekt módon oxidált monomer szomatotropint, és nem szükséges feltétlenül eltávolítani ezeket a redukáló ágenseket a szóban forgó szomatotropin oxidációja előtt. Az E. coli gazdasejtben kifejezett N-metionil-bovin szomatotropin és N-metionil-porcin szomatotropin esetében úgy találtuk, hogy a fehérje a fénytörö testecskékben lényegében redukált formában van jelen (diszulfidkötések nélkül). Ezáltal ezeknél a készítményeknél a redukáló reagensek alkalmazása szükségtelen. A jelen eljárás egy másik szempontja szerint továbbá azt találtuk, hogy amikor szolubilizálunk, az ilyen szomatotropinok könnyen transzformálódnak nativ formájukká. Natív formájukban a szomatotropinok két intramolekuláris diszulfid-hidat tartalmaznak négy cisztein-gyök között. Nem szerencsés módon amikor a redukált formából elvégezzük az oxidálást, a ciszteingyökök kombinálódhatnak a két intramolekuláris kötés képzése közben, és az intramolekuláris kötések három lehetséges útja közül csupán egy kombináció határozza meg a nativ formát. Hasonlóképpen az egyik szomatotropin molekulából származó cisztein-gyökök diszulfid-hidakat képezhetnek egy másik molekulából származó cisztein-gyökökkel dimereket, trimereket és magasabb oligomereket képezve. A korrekt módon kialakult monomerek arányát a nem korrekt módon kialakult monomerekhez és oligomerek-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
