201093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére
13 HU 201093 B 14 hez viszonyítva befolyásolják azok a körülmények, amelyek között a szomatotropin fehérjét .kigöngyöljük" és oxidáljuk. A jelen felfedezés előtt az volt az állandó biokémiai gyakorlat, hogy amikor helyreállitották a fehérjét, átvitték a fehérjét a denaturáló oldatból (azaz a kaotróp oldatból) valamilyen elfogadható puffer-oldatba, pl. nátrium-hidrogén-karbonát oldatba a szóban forgó fehérjének megfelelő pH-nál valamilyen redukálószer jelenlétében lásd: Stryer: Biochemistry, 32-35 oldal, kiadó: W.H. Freeman and Company (2. kiadás, 1981); Bewley és munkatársai: .Human Pituarity Growth Hormone" - The Reduction and Reoxidation of the Hormone (.Emberi hipofízis növekedési hormon’ - A hormon redukciója és re-oxidációja). Archives of Biochemistry and Biophysics, 138, 338-346 (1970). Az alkalmazott pufferoldat térfogata olyan volt, hogy a fehérje-koncentráció egészen alacsony, általában 1,5 mg/ml legyen. A fehérje oxidálását azután a levegőnek való kitevéssel hajtották végre. A diszulfid kötések kialakítását fehérjékben olyan módon is javasolják, hogy bázissal katalizált szabad-gyókös mechanizmussal történjék, amint ezt a March in Adv. Organic Chemistry című kiadványban (McGraw Hill, 1977) leírták. Mivel az oxidációs lépés bázissal katalizált, előnyösen alkalikus pH-nál hajtják végre. Bár a diszulfid - hidakat képző oxidációs reakció 7-nél nagyobb pH-nál végbemegy, a műveleti pH előnyösen a fehérje szulfhidril-csoportja pH-ja (-8,4) fölött legyen. Pontosabban a műveleti pH 9 és 12 között előnyös. Ha puffert használunk, trisz-(hídroxi-metil)-amino-metán az előnyös puffer. A korábbi gyakorlattal ellentétben azt találtuk, hogy a szomatotropinokat hatásosan helyre lehet állítani, miután már feloldottuk karbamid- vagy dimetil-szulfon-oldatban, az oldatot valamely enyhe oxidálószerrel, pl. hidrogén-peroxiddal vagy levegővel érintkezésbe hozva annyi ideig, hogy a szulfhidril -csoportok oxidálódjanak, intrámolekuláris diszulfid-kötéseket képezve. Azt találtuk továbbá, hogy a helyreállítást akár 30 mg/ml szomatotropin-koncentcációnál is végrehajthatjuk, de előnyösen azonban kevesebb, mint 30 mg/ml és még előnyösebben kevesebb, mint 20 mg/ml koncentrációnál. A helyreállítás hatásos módon megy végbe a gazdasejt szennyező fehérjéinek jelenlétében is redukáló reagensek jelenlétében vagy távollétében egyaránt. A szomatotropin monomer mennyiségét bármilyen alkalmas biokémiai technikával meghatározhatjuk, mint pl. radioimmunassay-val (RIA), méret-kizárásos kromatográfiával, és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC). Exogén redukáló ágensek távollétében, mint pl. ß-merkapto-etanol és 1,4-ditiotreitol, vagy oxigén kizárására tett óvintézkedések nélkül a szomatotropin molekula oxidálása a szolubilizáláskor elkezdődik. A karbamid koncentrációja, úgy tűnik, a leginkább befolyásoló paraméter, amely a biológiailag aktív szomatotropin monomer kitermelésére hat. Valójában az oxidáció lényegében bármilyen karbamid-koncentrációnál végbemegy, amelynél a szomatotropin oldott állapotban marad. Megérthető, hogy amikor szolubilizáltuk, a szomatotropin csökkentett hőmérsékleten, 1 mól/liter vagy kisebb karbamid-koncentrációnál oldatban marad. Ezáltal hogy maximumra emeljük az ilyen monomerek termelését, a karbamid-koncentrációtól át kell állítani a szolubilizálási lépésben felhasznált koncentrációról arra a koncentrációra, amelyet a helyreállítási lépéshez optimálisnak határozunk meg. A szóban forgó optimális koncentráció szükségszerűen függ az adott szomatotropintól. Amikor a szolubilizálás után a karbamid-koncentrációt kívánatos csökkenteni, a hígítást desztillált víz vagy pufferoldat hozzáadáséval lehet végrehajtani. Lehet választani redukálószerek alkalmazását is, hogy enyhítsük a gyors akció szükségességét a karbamid-koncentráció beállítására. Redukáló anyag távollétében a monomer-kitermelés MBS-nél csökken, eltelt óránként mintegy 5 súly%-al a karbamid-koncentráció higítása előtt, amikor 7,5 mól/literes karbamid-oldatot alkalmazunk a szolubilizáláshoz. (MBS=N-metionil-bovin szomatotropin). N-metionil-bovin szomatotropin esetében a helyreállítás során 4 mól/liter és 5 mól/liter közti karbamid-koncentráció az előnyős. A helyreállítás mintegy 4,5 mól/liternél tűnik optimálisnak, csökkentett monomer-kinyeréssel és megnövekedett aggregátum-képződéssel mind az ennél kisebb, mind az ennél nagyobb karbamid-koncentrációknál. Ennek megfelelően ha 7,5 mól/liter karbamidot alkalmazunk a szolubilizációnál, előnyös a gyors hígítás desztillált vízzel vagy megfelelő pufferrel, mint pl. trisz-szel 4,5 mól/liter karbaraid-koncentrációra, ha redukálószer nincs jelen, hogy minimálisra csökkentsük a nagyobb, nem optimális karbamid-koncentrációt. N-metionil porcin szomatotropin esetében, amely az MBS-től 18 aminosavban különbözik, a reaktiválás során a 2,5 mól/liter és 3,5 mól/liter közti karbamid-koncentrációk az előnyösek. A helyreállitás 3 mól/liter karbamid-koncentrációnál tűnik optimálisnak, csökkentett monomer-kinyeréssel és megnővekedett aggregátum-képződéssel mind az ennél kisebb, mind az ennél nagyobb karbamid-koncentrációknál. Hasonlóképpen a gyors hígitás 7,5 mól/liter karbamid-koncentrációról 3 mól/literre jó keveréssel megfelelő pufferral, pl. trisz-szel előnyös, ha redukálószer nincs jelen, hogy minimálisra csökkentsük a nagyobb, nem optimális karbamid-koncentrációt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
