200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
11 12 HU 200795 B egér-sejtekben tud replikálódni, extrakromoszomális episzómaként. A fertőzött sejteket a transzformált fenotipusra nézve lehet kiválogatni. A kifejeződő vektor további módosítása is lehetséges, pl. a nagyobb arányú kifejező- 5 dés érdekében fajlagos fokozó elemek hozzáadása, vagy gyógyszerrezisztencia (pl. neonácin rezisztencia) beiktatása a génbe. HÁRMAS-HURKOT TARTALMAZÓ PLAZMINOCÉN 10 AKTIVÁ TOR Szöveti plazainogén aktivátor Hírvivő (messenger) RNS Teljes RNS-t izoláltunk izotiocianátos 15 módszerrel (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 196. oldal) normál humán fib— roblaszt sejtekből (WI-38 sejtek), amelyeket előzőleg stimuláltunk endotelíális sejtnővekedési faktorral (ECGF) és heparinnal t-PA 20 termelése érdekében. Ugyanezek a stimulált sejtek termelnek urokinázt. Hírvivő RNS-t (mRNS) nyertünk a teljes RNS-ből egy oligo-dezoxitimidin (dT)-cellulóz oszlopon végzett kromatográfiával [Aviv és munkatársai: Proc, 25 Nat’l. Acad. Sei. USA, 69, 1408 (1972)). Az mRNS további frakcionálását 15-30%-os szacharóz gradiensben végzett centrifugáléssal végeztük, és az egyes mRNS frakciókat ^P-vizsgáló mintákkal hibridizáljuk (amint ezt 30 alább leírjuk). A t-PA .üzenetet' tartalmazó frakciókat (kb. 20-24 S) összegyűjtöttük a komplementer DNS (cDNS) előállításához. Komplemeneter DNS 35 Az előző pontban leirt módon összegyűjtött mRNS-t (5 Mg) használtuk kétszálú cDNS előállítására, és a cDNS homopolimer, polidezoxieitidil (poli-dC) farkakkal láttuk el termi- 40 nélis nukleotid transzferázt alkalmazva. A terméket összeforrasztottuk Pstl-el emésztett, polidezoxi-guanilát (poli-dG) farkakkal ellátott pBR322-vel. Az összeforrasztott DNS-t alkalmaztuk kompetens E. coli 249 törzsek 45 transzformálására, amelyeket tenyésztettünk, hogy mintegy 10* bakteriális kiónt nyerjünk (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 229. oldal). 50 t-PA klón átvizsgálása és azonosítása 32P-ATP-vel végzett radioaktív jelzés után a következő három oligonukleotidot alkalmaztuk rekombináns kiónok könyvtárának 55 átvizsgálásához. Ezek az oligomerek a t-PA molekula {Pennies, D. és munkatársai: Nature, 301, 214 (1983)] 34-39. aminosavainak (17- -mer), 253-258. aminoavainak (18-mer), és 523-527. aminosavainak (15-mer) felelnek 60 meg: a 17-mer: 5'-CCACTGTTGCACCAGCA-3’; a 18-mer: 5’-CACATCACAGTACTCCCA-3’; a 15-mer: 5’-CGGTCGCATGTTGTC-3’. Mintegy 20 telep mutatott mérsékelttól-erősig terjedő horoológiát az összegyűjtött vizsgáló minták- 65 8 kai. Ezeknek a telepeknek az újból lemezre helyezése és újra-hibridizálása 16 pozitív jelt mutató kiónt adott. Az ezekből a klónokból készített plazmid DNS-t nitrocellulóz lemezre itattuk és egyedi vizsgáló mintákkal híbridizáltuk. Két klón (42 és 62a) hibridizálódott mind a középső (18-mer), mind a 3’-vég (15-mer) vizsgáló mintákkal. A plazmid DNS Pstl-gyel végzett, enzimes emésztése azt mutatta, hogy a 42. számú klón tartalmazta a több, mint 2 kilobázis (Kb) nagyságú legnagyobb beiktatást három fragmens (1,1; 0,6 és 0,4 Kb) formájában. A klón (pWP42) teljes restrikciós térképét a 2. ábra mutatja be. Ez a klón tartalmazza a t-PA génhez tartozó teljes hosszúságú szekvenciát, amely 2600 bp-t tartalmaz, és amely magában foglalja az 5'- és 3'- le nem fordított területeket. A t-PA-gén összeszerkesztése Mintegy 10 Mg pWP42 plazmid DNS-t emésztettünk 9 egység XhoII-vel 37 °C hőmérsékleten 2 órán át. A reakciókeveréket 1,2%-os preparativ agaróz gélen futtattuk, és egy 1618 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroforézissel. Miután a kohézív végeket kitöltöttük E. coli polimeráz I-el (Klenow-fragmens) és a dNTP-kel (a négy dezoxinukleotid trifoszfát: dATP, dGTP, dCTP és dTTP), 1 Mg így módosított DNS-t ligáltunk egy éjszakén ét 300 ng foszforilezett Sail linkerrel. Fenol/kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 50 egység Sall-el emésztettük 4 órán ét, és a reakciókeveréket 1%-os preparativ agaróz gélre tápláltuk, hogy izoláljuk a kívánt DNS fragmenst. A Sáli végekkel rendelkező DNS-t Sall-el hasított pUC 13-hoz ligáltuk, és ezt a terméket felhasználtuk E. coli JM 103 sejtek transzformálására; az így nyert sejteket ampicillint és X-galt tartalmazó lemezekre szélesztettük. Nyolc ampicillin rezísztens, fehér telepet különítettünk el és növesztettünk, hogy miniplazmid készítményt készíthessünk. Két klónról (ptPS34B és ptPS39) úgy találtuk, hogy tartalmazza a kivént DNS fragmenst. 10 Mg ptPS39 plazmid DNS-t emésztettünk teljes mértékben BamHI-vel és Narl-el, és ezt a terméket preparativ agaróz gélen futtattuk, Így egy 1288 bp-s fragmenst nyertünk, amely a t-PA C-termínálisát kódolja. A t-PA gén 5’ végét úgy nyertük, hogy 10 Mg pWP42-t emésztettünk 4 egység Hgal-el 37 °C hőmérsékleten 8 órán át. Egy 515 bp-s frgmenst izoláltunk lX-os agaróz gélen végzett elektroforézissel. Ennek a DNS fragmensnek a kohéziv végeit betöltöttük DNS polimerázzal (Klenow-fragmens) és a dNTP-kkel, és az így nyert terméket Smal-el hasított pUC 13-hoz ligáltuk. Miután az így nyert teméket E. coli JM 103 sejtekbe transzformáltuk, mintegy 75 ampicillin-rezisz-
