200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
13 HU 200795 B 14 tens, fehér telepet nyertünk. Ezekből a telepekből 24 telepet növesztettünk abból a célból, hogy mini-plazmid készítményt állítsunk elő. A mini-plazmid készítményt Narl-el emésztettük, és 17 klónról találtuk azt, hogy rendelkezik és kívánt beiktatással, valamelyik orientációban. Egy kiónt (pt PHga 4) növesztettünk 1,0 liter, ampicillint is tartalmazó LB tápközegben, hogy nagy mennyiségű plazmid DNS-t nyerjünk, a plazmid DNS-t a forralásos módszerrel nyertük ki. A pt PHga 4 plazmid DNS-t BamHI-vel és Narl-el emésztettük, és l,2X-os agaróz gélen elektroforézisnek vetettük alá, Így izoláltuk egy 434 bp-s DNS fragmenst, amely a t-PA N-terminálisát kódolja. A fenti 1288 bp-s DNS-t (300 ng) és ezt a 434 bp-s DNS-t (100 ng) egy éjszakán ót ligáltuk, így egy 1722 bp-s DNS fragmenst kaptunk. Ezt a DNS-t BamHI-vel hasított pUC 13-mal ligóltuk, és az Így nyert terméket használtuk E. coli JM 103 sejtek transzformálására. Több, mint 1000 ampicillin rezisztens telepet nyertünk. 20 telepből plazmid DNS-t nyertünk a forralásos módszerrel. A plazmid DNS-t BamHI, NarI és XhoII enzimekkel egyenként végzett hasításokkal azonosítottuk. Az összes így létrejött plazmidról azt találtuk, hogy tartalmazzák a kívánt 1722 bp-s DNS fragmenst. Az egyik plazmidot (pt PBM1) alkalmaztuk nagy léptékű plazmid DNS előállításához. Ez a plazmidból BamHI-vel végzett hasítással kaptuk az 1722 bp-s DNS-t, amely a teljes t-PA molekulát kódolja. A pt PBM1 klón restrikciós térképét és előállításának vázlatos diagramját a 3. ábra mutatja be. Urokináz plazminogén aktivátor (u-PA) Az u-PA klón átvizsgálása és azonosítása 10 105 rekombináns baktérium klón, amelyekből a t-PA gén származik (lásd fentebb), könyvtárát átvizsgáltuk egy radioaktívan jelzett 18-mer vizsgáló mintával Grunstein és munkatársai módszere szerint [Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). A vizsgáló minta, amelyet a standard foszfotriészter módszerrel állítottunk elő Gene Machine (Applied Biosystems) berendezést alkalmazva, az 5’-GTA GAT GGC CGC AAA CCA-3’ oligomer szekvenciát mutatta, amely megfelel az urokináz gén középső részének (aa173-179). Mintegy 13 klón mutatott mérsékelttől erősig terjedő hibridizálási jelet. Ezeket a kiónokat 2 ml, tetraciklint is tartalmazó LB tápközegben növesztettük, és miniplazmid készítményt állítottunk elő ezekből. A miniplazmid készítményt feloldottuk 40 pl HíO-ban, amely 10 pg/ml RN-ázt is tartalmaz. Mintegy 8 pl így előállított DNS-t emésztettünk 1 egység Pstl-el, és a terméket elektroforézissel különítettük el lX-os agaróz gélen. A klónról (pUK 53) úgy találtuk, hogy tartalmazza az 1,7 Kb-s legnagyobb beiktatást három beiktatás (1,2; 0,4 és 0,1 Kb hosszú) formájában. Az urokináz teljes 3’-vég nukleotid szekvenciája a Pstl-el hasított 1,2 Kb-s DNS fragmensben volt jelen. A gén 5’-végi szekvenciáját Maxam és Gilbert módszere [Methods Enzimol. 65, 1499 (1980)] szerint végzett nukleotid szekvencia elemzéssel határoztuk meg, és kiderült, hogy az urokináz fehérje szignál peptid kódoló terület első 10 aminosavának megfelelő mintegy 30 nukleotídja hiányzik. Ezért a hiányzó nukleotidoknak megfelelő kettős DNS szekvenciát szintetizáltuk és meglevő génhez ligóltuk. Az urokináz gén összeszerkesztóse Az urokináz plazmid (pUK 53) DNS-t Ncol-el és MstlI-vel elhasitottuk, és a termékeket elektroforézissel elkülönítettük lX-os agaróz gélen. Egy 1198 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval. A DNS fragmens 5’-kinyúló végét, amely az Ncol hasításnak felel meg, tompa végűvé tettük, dNTP-kkel és E. coli DNS- polimerázzal (Klenow fragmens) betöltve. A DNS-t azután Smal-el hasított pUC13-hoz ligáltuk, és ezt a módosított plazmidot alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. A beiktatott rész Ncol helyét regeneráltuk, amikor a DNS-t a pUC 13 Smal helyéhez ligáltuk. A sejteket ampicillint és X-galt tartalmazó lemezekre szélesztettük, és a fehér telepekből ' mini-plazmid készítményeket termeltünk. A mini-plazmid DNS készítmény emésztése Ncol-el és Sall-el egy mintegy 1200 bp-s DNS fragmenst eredményezett. Egy pozitív klónból (pUKNM-3’) nagy léptékű plazmid DNS készítést végeztünk, az igy nyert terméket pedig Ncol-el és Sall-el emésztettük, hogy nagy mennyiségű, mintegy 1200 bp-s DNS fragmenst nyerjünk, amelyet preparatív agaróz gél elektroforézissel különítettünk el. Hogy az urokináz fehérje 5’ szignál-peptidje első 10 aminosavót kódoló területnek megfelelő, mintegy 30 nukleotidot tudjuk előállítani, pUK 53 plazmid DNS-t először Pstl-el emésztettük, . és egy 400 bp-s DNS fragmenst izoláltunk. Ezt a DNS-t azután ScrFI-el kezeltük, igy a DNS egy 242 bp-s fragmensét állítottuk elő. A DNS kinyúló végeit dNTP-kkel és DNS polimeráz I-el (Klenow-fragmens) töltöttük be. Két komplementer oligonukleotid szekvenciát, 38 és 42 bázis hosszúságúakat, szintetizáltunk Gene Machine berendezésen, hogy a hiányzó aminosavhoz (-9-től -20-ig) a megfelelő leolvasó keret megtartása és a Sall-el hasított pUC 13-ban való szubklónozáshoz a DNS mindkét végén Sáli szekvencia biztosítása mellett. A két oligomert ekvimoláris menynyiségben ligáz pufferban (50 mmól/1 trisz-HC1, pH 7,6; 10 mmól/1 MgCh, 10 mmól/1 ditiotreitol) összekevertük, és melegítettük 80 °C hőmérsékleten 5 percen át, majd hagytuk lehűlni szobahőmérsékletre mintegy 1 óra 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
