200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
9 HU 200795 B 10 midok a lac Z génen belül egy, a következő többszörös klónozó vagy restrikciós helyet tartalmazó szekvenciát tartalmazzák: ----ACGCCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGCGAGCTCGAATTCACTG----A 11 hely bármelyikében való klónozást fehér rekombináns telepek megjelenésével le-' hét megfigyelni a kék vektor-telepek hétté- 25 rében egy X-gal-t (5-bróm-4-klór-3-indolil-/3-D-galaktozid) tartalmazó indikátor-lemezen [Rüther: Mol. Gen. Genetics 178, 475 (1980)]. A rekombináns pUC plazmiddal való transzformáláséhoz alkalmazott E. coli törzs a 30 JM103. A pUC plazmidot és az E. coli JM103 törzset a Pharmacia P-L Biochemicals-tói (Milwaukee, Wisconsin) szerezzük be. g.) Gazda/vektor rendszer 35 1. ) Mikrobiológiai rendszer Az itt leírt munkát az E. coli K-12 JM103 (PL Biochemicals) és az E. coli K-12 MM294 (ATCC 33625) törzsekkel hajtottuk végre. Az eljárásban alkalmazhatunk egyéb 40 E. coli törzseket és Bacillusokat, mint pl. Bacillus subtilist. Mindezek a mikroorganizmusok olyan plazmidokat hasznosítanak, amelyek replikálódni és heterológ génszekvenciákat kifejezni képesek. 45 Az élesztőben levő kifejeződő rendszerhez olyan plazmidot alkalmazhatunk, amely képes kiválasztódni és replikálódni E. coli-ban és/vagy élesztőben (Saccharomyces cerevisiae). Az élesztőben való kiválasztódáshoz 50 a plazmid a TRP 1 gént tartalmazza, amely triptofénra prototróffá teszi a transzfornált trp* élesztőtörzset (RH 218). Az élesztő kifejeződő vektor ingázhat az élesztő és az E. coli között. A plazmid a következő alkotóré- 55 székkel rendelkezik: 1.) pBR322-ból származó DNS szegmens, amely a replikációs origót és az ampicillin rezisztencia gént tartalmazza; 2. ) az élesztő TRP 1 gén; 3.) az élesztő 2 n DNS, amely képessé teszi a plazmidot, hogy 60 nagy stabilitással replikálódjék élesztőben; 4.) egy promoter terület az élesztő génből, pl. alkohol dehidrogenáz, gliceraldehid-3- -foszfót-dehídrogenáz, stb.; 5.) transzlációs rajt és átirási stop szekvenciák, amelyeket 65 az mRNS kifejeződő rendszerben történő megfelelő befejezéséhez és poliadenilezéséhez lehet alkalmazni. 2. )’Emlős sejttenyészet rendszer Heterológ fehérjék termeléséhez összeférhető vektor replikálására és kifejezésére képes emlős sejtvonalakat alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárásban. Ilyenek pl.: Cos-7; W138; 3T3; CHO; Hela sejtek, és a C127 sejtek. Az alkalmazott vektorok tartalmaznak: 1.) egy vírusból (SV40, adeno, polyoma, BPV) vagy celluláris kromoszomális DNS-ből származó replikációs origót; 2.) egy promotort; 3. ) a transzlációs beindító szignálokat, mint pl. a riboszomális kötőhelyek'; és 4.) RNS kezelő szignálokat (RNS összesodró poliadenílező és átirás-befejezó szekvenciák.) A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kifejeződő vektorok előnyösen egy BPV virus replikációs origót, egy egér metallotionein promotort és SV40 RNS kezelő szignálokat tartalmaznak. A vektor ingázhat is emlős sejttenyészet és E. coli között. Ez a pBR322 szekvenciák származékait tartalmazza, igy az E. coli ampicillin rezisztencia szelektálható markereit, valamint a DNS replikálódás E. coli origóját tartalmazza. Ezek a szekvenciák a pML-2d plazmidból származnak. A BamHI .ragadós" véget tartalmazó, összeszerkesztett hibrid plazminogén aktivátor gént először beiktatjuk 0,341-3 plazmid [Law M.F. és munkatársai: Mol. Cell Biol. F 3, 2110 (1983)] BglII helyre az egér metallotionein átírási promoter elem és az SV40 korai terület átírási szignáljai közé. A 142-6 plazmid (ATCC 37134) BamHI-vel végzett emésztése után nyert terjes BPV genomot ligéljuk az egyedi BamHI helyre. A 341-3 plazmid szintén tartalmaz pML2-t, amely egy pBR322 származék, és amely lehetővé teszi a plazmid replikálódását baktériumsejtekben. Az itt megalkotott kifejeződő plazmid kizárólag C-127 7
