200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
3 HU 200795 B 4 zeteket, amelyek a fent említett fehérjékben találhatók. Az is nyilvánvaló, hogy a horog-területen polimorf formák is létezhetnek természetes formában, ahol egy vagy több aminosáv van hozzáadva, törölve vagy helyettesítve. Hasonló változásokat a fehérjékben is in vitro létre lehet hozni a gén pont-mutációjóval vágy bármilyen kívánt szekvenciával rendelkező gén kémiai szintézisével. Ezek a módosított szerkezetek ezért szintén beleértendők a .horog', .horgok' kifejezésekbe, ahogyan ebben a bejelentésben értelmezzük. A továbbiakban részletesen bemutatjuk egy hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátor, valamint egy négyes horgot tartalmazó plazminogén aktivátor előállítását. Az alkalmazott módszerek azokat a módszereket illusztrálják, amelyek alkalmazhatók a találmány szerinti más polipeptidek előállításához is. A találmány szerinti eljárással előállított hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátorok, amelyeket rekombináns DNS technikákkal urokináz és t-PA kiónok megfelelő genetikai kódoló szekvenciáiból alkotunk bármely natív plazminogén aktivátorral öszszevetve megnóvekedett stabilitást, a fibrinhez való megnövekedett kötő-affinitást és megjavult fél-élettartamot mutatnak. A hármas horgot tartalmazó plazminogén akti vétó-' roknak ezek a tulajdonságai megjavult biológiai potenciált és megjavult tárolási élettartamot eredményeznek. A hármas-horog-PA molekulát könnyebb kezelni az előállítás és tisztítás közben, mint a natív t-PA-t, mivel az utóbbi, tenyészfolyadékokban és különböző tisztítási stádiumokban található polipeptid, kis molekulatömeggel rendelkezik, és nehéz és könnyű lánc fragmensekkel társul. A négyes horgot tartalmazó plazminogén aktivátor, valamint a többi többszörös horgot tartalmazó plazminogén aktivótorok szintén ezeket a tulajdonságokat mutatják. A találmány szerinti eljárással előállított hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivótort az urokináz N-terminális részéből alkotjuk meg, egyedi horog területén keresztül t-PA-nak olyan részével kombinálva, amely a kettős horog terület kezdeténél vagy az előtt kezdődik, és megfelelő kapcsolón (linkeren) át történik az összekombinálás. Az urokináz egyedi horgáról ismeretes, hogy megelőzi a 131. számú aminosav helynél levő glicin gyököt. A t-PA kettős horgáról ismeretes, hogy a ciszteinnél kezdődik, amely egy 91. helyzetnél levő treonin gyököt követ. így az urokináz N-terminális vége, amely a 131. szómnál levő glicin gyöknél fejeződik be, adott esetben megfelelő kapcsolón keresztül (amely kapcsoló a t-PA két hurka közti hexapeptid-kapcsolatot utánozza) egy t-PA molekulához kapcsolódik, amelyből az első 91 N-terminális aminosavat töröltük. Az így létrejött hibrid molekula 46 aminosav-győkkel nagyobb, mint a t-PA, olyan fehérje, amelynek molekulatömege mintegy 73000 (a t-PA molekulatömege 68000), az alkalmazott kapcsolótól (linker) függően. Hasonlóképpen, az urokináz egyedi horgát (UKKaa 50-131), egy horog-kapcsolóval összekötve, a t-PA polimerbe a 91-92 vagy 261-262 aminosavak közé iktatjuk be, így két különböző gént hozunk létre a hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátorok előállításához. Hasonlóképpen, standard módszerekkel, megfelelő kapcsolókkal a két t-PA hurok közé az u-PA horgot be lehet iktatni. Ezen kívül a protrombinban vagy plazminogénben található horgokat izolálni lehet, és a fentebb említett t-PA bármely helyére be lehet iktatni. A többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok bármelyikének találmány, szerinti megalkotása az említett alapon történik úgy, hogy fehérjéből egyedi vagy kettős horog területeket izolálunk, és ezeket a t-PA molekula-gerincébe beiktatjuk. Az urokináz (UKK) egyedi horog-részének a t-PA kettős horog-területéhez (t-PKl és t-PK2) történő kötéséhez alkalmazott horog-kapcsolók olyan polipeptidek, amelyek 6- -10 természetes aminosavgyökőt tartalmaznak. A horog-kapcsolót előnyösen úgy választjuk ki, hogy ahhoz hasonló térbeli elrendeződést tartson fenn, mint amilyen a t-PA két horga között fennáll. Ilyen előnyös kapcsoló pl. az L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp, mivel ez azonos azzal, amely a t-PKl-et at-PK2-vel összeköti a t-PA-ban. Az L-Thr-L-Asp-L-Ala-L-Glu-L-Thr-L-Glu hexapeptid pl. egy másik alkalmazható hexapeptid kapcsoló, és L-Ala, Gly, L-Ser, L-Glu, L-Thr és L-Asp bármilyen kombinációját lehet alkalmazni a hexapeptid kapcsoló N-terminális vagy C-terminális végeinél, hogy hepta-, okta-, nona- vagy dekapeptid kapcsolat nyitottabb szerkezetét biztosítsuk a t-PA horgok és az UK horog között. Más kapcsolók is nyilvánvalók a vegyészek számára. Egyszerűség kedvéért a továbbiakban említett horog-kapcsolóknál a fentebb emlitett előnyös kapcsolókra szorítkozunk. A hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátorokat úgy állítjuk elő, hogy urokinázt és t-PA-t kódoló szekvenciákat korlátozott emésztésnek vetünk alá kiválasztott restrikciós enzimekkel, hogy a kívánt u-PA és t-PA fragmenseket nyerjük. A fragmenseket agaróz vagy akrilamid gélen végzett frakcionálással izoláljuk, ligáljuk, és klónozáshoz és az ezt követő kifejeződéshez megfelelő vektorba vagy vektorokba vezetjük be. A továbbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit. Az 1. ábra a találmány szerinti eljárással előállított három hármas-horgot tartalmazó plazminogén aktivátor és egy négyes-hor-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
