200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
5 HU 200795 B 6 A 2. ábra A 3. ábra A 4. ábra Az 5. ábra A 6. ábra A 7. ábra A 8. ábra A 9. ábra A 10. ábra got tartalmazó plazminogén aktivátor vázlatos elrendezését mutatja be. A bemutatott 1. szerkezetek (a-c) sötétített része az urokináznak az uro- 5 kinéz horgot (UKK) tartalmazó részét jelenti. Az 1(d) szerkezet sötétített része a protrombin (PTK1 és PTK2) kettős horog területét jelenti. A tPKl 10 és tPK2 rövidítések a szöveti plazminogén aktivátor 1. illetve 2. horgait jelentik, a pWP-42 szöveti plazminogén aktivátor rekombinéns klón 15 restrikciós térképét mutatja be. a ptPBM-1 plazmidnak a pWP- 42-ből való előállításánál követett technikát mutatja be. A 20 ptPBM-1 tartalmazza a teljes t-PA molekula előállításához szükséges genetikai infoi'mációt. a pUKBM plazmidnak a pUK-53 25 plazmidból való előállításánál követett techikát mutatja be. A pUKBM tartalmazza a teljes urokinéz fehérje előállításához szükséges genetikai informáci- 30 ót. az 1(a) ábrán vázolt hármas-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításánál követett módszer folyamatábráját 35 mutatja be. az urokináz 51-131, aminosavait kódoló gén (u-PA51-131) előállításánál követett módszer folyamatábráját mutatja be. 40 az 1(b) ébrén vázolt hármas-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításánál követett módszer folyamatábráját mutatja be. 45 az 1(c) ábrán vázolt hármas-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításánál követett módszer folyamatábráját mutatja be. 50 az 1(a) ábra termékét kódoló gén DNS szekvenciáját mutatja be, jelölve az urokinéz szignál peptid területet (20 aminosav), az UKK területet (az urokinéz 55 1-131. aminosavai), a hexapeptid kapcsolót és a t-PA molekula további részét (92-527. aminosavak). az 1(b) ábra termékét kódoló 60 gén DNS szekvenciáját mutatja be, jelölve a t-PA szignál peptidjét (35 aminosav), a t-PA N-terrainális részét (1-91. aminosavak), az UKK-t (az 65 A 11.- ábra A 12. ábra A 13. ábra A 14. ábra A 15(a) ábra A 15(b) ábra A 15(c) ábra urokináz 50-131. aminosavai), a hexapeptid kapcsolót és a t-PA C-terminális részét (92— -527. aminosavak). az 1(c) ábra termékét kódoló gén DNS szekvenciáját mutatja be, jelölve a t-PA szignál peptidet (35 aminosav), a t-PA N-terminélis részét (1-261. aminosavak), a hexapeptid kapcsolót, az UKK-t (az urokináz 50-131. aminosavai), és a t-PA C-terminális részét (262— -527. aminosavak). a protrombin kettős-horog területét kódoló gén előállításában követett módszer folyamatábráját mutatja be. az 1(d) ábrán bemutatott négyes-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításában követett módszer folyamatábráját mutatja be. az A Hibrid plazminogén aktivátor [az 1(a) ábrának mefelelő] és a B Hibrid plazminogén aktivátor [az 1(b) ábrának megfelelő] gének C-127(egér) emlős sejtvonalban való kifejeződéséhez tervezett BPV-I alapú kifejeződő vektorrendszert mutatja be. A kifejezni kívánt gének az egér metallotionein transzkipciós promoter elem és az SV40 korai transzkripciós szignál közé vannak beiktatva. a PA-termelö sejtek vagy gócok átvizsgálását mutatja be fibrin agar lemezen, 10 pl tenyésztő tápközeget alkalmazva üregenként és 37 °C hőmérsékleten inkubálva mindaddig, amíg a tiszta zónák az üregek körül feltűnnek (2. és 7. vonalak). Az 1. vonal mutatja a standard t-PA-t a következő enzim-koncentrációkkal (egység/ml) felülről lefelé: 500; 250; 100; 50; 25; és 0. B Hibrid, A Hibrid és szöveti típusú plazminogén aktivátorok fibrin-agar lemezen készített zimogrammját mutatja a PA-hibridek poliakrilamid gélen (PAGE) elektroforézissel végzett elválasztása után. 35S-sel jelzett A Hibrid, B Hibrid plazminogén aktivátorok autoradiogramját mutatja, be radio-impulzusos közeg anti-t-PA antiszérummal végzett immuno-kicsapása és nem redukáló nátrium-dode-5
