200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
17 HU 200794 B 18 Northern-foltképzésre (Thomas, P.S.: Proc. Natl. Acad. Sei. US1. 77, 5201-5, /1980/). Három rekombinánst, pFC15-ôt, pFC16-ot és pFC17-et 1,6 kb-s, illetve 2,3 kb-s, illetve 1,1 kb-s cDNS beiktatásokkal hibridizáljuk 9 kb, illetve 7,5 kb, illetve 5 kb-s méretű mRNS-ekhez. pFC17-ből izolált beiktatott DNS-t Bal 31 exonukleázzal, hogy véletlenszerű leolvasó kereteket nyújtsunk, és beiktatjuk a triptofán-operon egy részét hordozó kifejeződő plazmidba. A DNS-t a BsshII helyre iktatjuk be, 13 aminosav-helyre az érett trpE karboxi-végződésétől, az antranilát-szintetáz I-nél. A cDNS beiktatása a fázison belülre ebbe a helybe egy fúziós fehérjét ad, amely az antranilát szintetáz I 56000 molekulatómegű részét hordozza. A gén indukciójára ß-indol-abrilsav jelenlétében triptofán éhezéssel a létrejövő rekombinánsok egyike, a pFT1733, egy 72000 molekulatőmegű fúziós fehérjét ad (amelyet SDS-PAGE-val határozunk meg), egy további 16000 molekulatömegű, a cDNS beiktatás által kódolt részt képviselve. A bakteriális extraktumokat és a P. falciparum schizontáinak extraktumait SDS poliakrilamid gél elektroforézisnek vetjük alá, étvisszük nitrocellulózra, majd P.195-re fajlagos polivalens nyúl-szérummal vizsgálatnak vetjük alá. Az antiszérum nagy mértékben fajlagos P.195-re, mivel egy teljes P. falciparum schizonta extraktumból csupán a P.195- -öt mutatja ki. Nem volt reakció olyan bakteriális extraktummal, amely egy trp E gén terméket tartalmazó 80000 molekulatőmegű fúziós fehérjét tartalmaz, vagy a száj- és körömfájás virus VP1 fehérjéjével sem. Ezen kivül normál nyúlszérumot alkalmazó kontroll sem mutatott kötést. így a pFC 17 a P. falciparum P.195 antigén determinánsaiból néhányat kódol. További referenciák a pFC17-re szinonimjánál, a pFcl017-nél lesznek találhatók. 2. példa ApPFcl017-re vonatkozó további átfedő cDNS kiónok előállítása Rekombináns cDNS könyvtárat hozunk létre méret szerint frakcionált cDNS-ból. Az 1. példában leírtak szerint készitett és farokkal ellátott cDNS-t centrifugálunk 5 ml 5X-20X (súly/térf.l szacharóz gradiensen keresztül 25 mmól/liter Tris-HCl-t (pH 7,4), 100 mmól/liter NaCl-t és 2,5 mmól/liter EDTA-t tartalmazó ol'datban 3,5 órán át 45 000 fordulat/percnél egy SW50.1 rotorban (Beckman Instruments). A 2 kbp-8 kbp közti területben levő cDNS-t (100 ng) nyerünk ki, 300 ng, dG farokkal ellátott, Pstl-el emésztett pUC9-el forrasztjuk össze, és DH1 sejtek transzformálására használjuk fel ampicillin-rezisztenciára, 1200 rekombinánst nyerünk 6 agar lemezen. Replika lemezeket vizsgálunk át pPFcl017-ből származó beiktatott DNS-sel, amelyet nick-Lranszlációval jeleztünk. 11 klónról azonosítjuk, hogy ehhez a vizsgáló mintához hibridizálódott DNS-t tartalmaz. Ezeket a kiónokat pPFcl001-1011 számozással látjuk el. Ezt a könyvtárat ezután újból átvizsgáljuk a pPFcl007-ben levő beiktatás egy részét alkalmazva, amely nem kereszt-hibridizálódik pPFcl017-el. További 8 kiónt, pPFcl028-1035 közti számozással izolálunk, amelyek hibridizálódnak ehhez a vizsgálati mintához. Egy további cDNS könyvtárat alkotunk meg 100 ng dC-farokkal ellátott cDNS-t alkalmazva; összeforrasztjuk 100 ng G-farokkal ellátott pUC 9-el és DH1 sejtekbe transzformáljuk. Mintegy 6000 rekombinánst nyerünk és ezeket átvizsgáljuk replika-szűrőkön a pPFcl017-ből származó 340 bp-s HindlII-PstI fragmenssel. A pPFcl013-1016 és 1018-1027 kiónokat, amelyek hibridizálódnak ehhez a vizsgáló mintához, kiemeljük és tisztítjuk. Ezt a könyvtárat szintén átvizsgáljuk a pPFcl007-ből származó vizsgáló mintával, és további 11 telepet, pPFcl036-1046 számmal emelünk ki. Az ezekből a cDNS klánokból származó plazmid- DNS-t centrifugálással tisztítjuk cézium-klorid gradiensen, és jellemezzük restrikciós enzimes térképezéssel és kereszt-hibridizálással. A cDNS kiónokat kiegyenesítjük egy átfedő lineáris szekvenciában. A szekvencia-elemzésben alkalmazott 6 cDNS klón helyzeteit a 2. ábrában mutatjuk be. 3. példa Genomiális pFGgl klón izolálása 100 g P. falciparum DNS-t (Odink és munkatársainak módszerével izolálva /1984/, fentebb idézett módszer) emésztünk a teljes emésztésig Hind III-al, a mintát 10-40X szacharóz-gradiensre terheljük, amely 1 mól/liter NaCl/t, 20 mmól/liter Tris-HCl-t (pH 8,0) és 5 mmól/liter EDTA-t tartalmaz, és centrifugáljuk Beckman SW 27 rotorban 24 órán át 26 000 fordulat/percnél, 20 °C hőmérsékleten. 0,5 ml-e8 frakciókat gyűjtünk a esőfenék átszúrásával és a váltakozó frakciók alikvotjait futtatjuk lX-os agaróz gélen. Nick-transzláción átesett pPFc 1017-vel végzett pont folt hibridizálásra pozitív jelet adó gradiens területében levő frakciókat emésztünk EcoRI-vel és ligálunk gélen tisztított HindlII + + EcoRI-vel hasított pUC8 DNS-hez. Mintegy 400 transzformánst DHI-ben minden egyes frakcióból átvizsgálunk nitrocellulóz szűrőkön pPFc 1017 beiktatással végzett telephibrid izálással (Grunstein, M. és Hogness, D.: Proc. Natl. Acad. Sei. 72, 3961 /1975/). Egy telep ad 39 frakcióból pozitív jelet Ez a rekombináns, a pPFgl, egy 3,1 kb-s HindlII-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
