200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
19 HU 200794 B 20 -EcoRI fragmenst tartalmaz, amely együtt vándorol a megfelelő genom DNS fragmenssel, és mindkettőnek azonos a restrikciós enzim térképe. A pPFgl restrikciós térképét a pPFgl beiktatás részleges vég-jelzett feltérképezésével nyerjük (Smith, H.O. és Birnstiel, M.L.: Nucl. Acid. Res. 3, 2387 /1976/). A szekvencia-meghatározást a Sanger didezoxi-módszerrel hajtjuk végre, amelyet az 5. példában írunk le. . 4. példa A P. falciparum DNS-ben levő P. 195 gén térképének elkészítése P. falciparum DNS-t készítünk, ahogyan ezt leírták (Odink és munkatársai /1984/, fentebb idézett munka), és ennek alikvotjait hasítjuk ki fajlagos endonukleázokkal, vagy egyes vagy néhány esetben kettős emésztéssel, azaz két restrikciós endonukleázzal. A termékeket elektroforézisnek vetjük alá agaróz géleken (0,7%-l,5%) Tris-borát-EDTA pufferban (pH 8,2), amely 0,5 pg/ml etidium-bromidot tartalmaz, az elektroforézist együtt végezzük ismert hosszúságú DNS fragmensekkel, mint mérő jelzésekkel, párhuzamos sávokon. A DNS-t átvisszük .Gene Screen Plus'-ra (New England Nuclear/Dupont) egy kapilláris folteljárással és hibridizáljuk ^P-vel jelzett DNS vizsgáló mintához 42 °C hőmérsékleten '50% formamid jelenlétében a szerint az eljárás szerint, amelyet a gyártó javasolt. A hibridizált vizsgáló minta DNS-t autoradiográfiával mutatjuk ki 70 °C hőmérsékleten X-Omat S filmet alkalmazva Cronex Lightning-Plus szúrók között. A vizsgáló minta DNS fajlagos plazmid DNS-re vagy a cDNS-ből kivágott fajlagos szekvenciákra vagy genomiális DNS plazmid kiónokra, és agaróz gélelektroforézissel és elúcióval van tisztítva. A DNS-t 32P-vel jelezzük E. coli DNS-polimerázzal végzett nicktranszlációval 32[P]oC-ATP jelenlétében. A fajlagos vizsgáló mintákhoz hibridizálódó genomiális DNS-en belüli területből restrikciós fragmensek méret-analízise lehetővé teszi a megalkotandó restrikciós enzim-helyek lineáris feltérképezését. A P.195 génnek egy ilyen térképét mutatja be a 3. ábra néhány példaszerű hellyel és vizsgáló mintával, amelyekhez a fajlagos fragmensek hibridizálódnak. Méltányolni lehet, hogy a genomiális DNS számos más fajlagos emésztését is végre lehet hajtani és le lehet vizsgálni a klónozott DNS-ből származó más fajlagos fragmansekkel is, és az eredmények egybevágnak a 3. ábrában bemutatott térképpel. Hogy javítsuk a térkép tisztaságát, olvashatóságát, nem az összes, a DNS szekvenciában jelenlevő restrikciós helyet tüntettük fel. A DNS szekvenciából származó genom-térkép és restrikciós térkép azt jelzi, hogy ezek ko-lineárisok a fehérjéhez szolgáló kó12 doló szekvenciának megfelelő területben, a 313. nukleotidnál levő Hindui hely jobb oldalán, Úgy tűnik azonban, hogy egy további 700 bp-s szekvencia is van a genom DNS-ben, amely nincs jelen a cDNS kiónokban, ez az Mbol hely és a HindlII helyek közt helyezkedik el a 221. és 313. nukleotidnál a cDNS szekvenciában. Ez égy intront képvisel a kódoló szekvenciának ugyancsak az elején. A térképen bemutatott helyek a következő enzim-helyek közül kerülnek ki: A(AluI), B(BamHI), E(EcoR), H(HindlII), M(MboI), N(Ndel), P(Pstl), Pv(PvuII), R(Rsal) és T(Taql). A vizsgáló minták vagy teljes plazmidok, vagy fajlagos enzimekkel végzett emésztéssel nyert fajlagos fragmensek, az emésztést a beiktatáson belül vagy a plazmid polilinker területen belül végezve. 5. példa P.195-ÔI kódoló DNS nukleotid-szekvenciája A DNS szekvencia-analízisét Maxam és Gilbert kémiai hasítási módszerét (Maxam és Gilbert, 1980, fentebb idézett munka) vagy Sanger dideoxi-módszerét (Sanger és munkatársai, 1977, fentebb idézett munka) alkalmazva végezzük el. 1.) Kémiai hasítás A szekvencia-analízishez alkalmas DNS fragmenseket a következő módon készítjük el. a. ) A DNS-t restrikciós endonukleázzal emésztjük (a szállító által leirt körülmények között), majd borjúbél alkalikus foszfatázt (Boehringer Mannheim) adunk a keverékhez és a reakciót 30 percen át folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. A DNS-t kloropánnal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS 5’ végeit fí2p]_vel jelezzük polinukleotid kinázt alkalmazva, amint ezt Maniatis leírta (Maniatis és munkatársai, 1982, fentebb idézett munka). A jelzett DNS-t egy másik megfelelő endonukleázzal elhasitjuk és a keveréket 1%-os (tömeg/térfogat) agaróz gélre visszük rá, a szóban forgó DNS csíkokat ebből az agaróz gélből elektromos úton eluáljuk és szekvenciájukat meghatározzuk. -b. ) DNS-fragmenseket készíthetünk az a.) részben leirt módszer módosításával is. A DNS-t restrikciós endonukleázzal emésztjük, foszfatázzal kezeljük és 5’ végén [^PJ-vel jelezzük, amint ezt fentebb körvonalaztuk. A DNS fragmenseket ezután denaturáljuk deionizált formamid hozzáadásával {végső koncentráció 70% (térf./térf.)}, és 100 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percen át A mintákat gyorsan lehűtjük jeges vizben és azonnal nem denaturáló 15%-os poliakrilamid gélre visszük (az akrilamid: bisz-akrilamid tömegarány 60:1). Az elkülönült DNS sávokat a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 C0 65
