200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
16 HU 200794 B pótban gyógyászatiig elfogadható detergens hozzáadásával. A vakcina tartalmazhat adjuvánst is az immunválasz stimulánsára és ezáltal a vakcina hatásának növelésére. Egy kellemes adjuváns a jelen találmányban való alkalmazásra az aluminium-hidroxid. Kényelmes formában a vakcinákat úgy szereljük ki, hogy az antigén-fehérje végsó koncentrációja 0,2 és 5 mg/ml, előnyösen 0,5- -2 mg/ml, legelőnyösebben 1 mg/ml legyen. A kiszerelés után a vakcinát be lehet helyezni egy steril tárolóba, amelyet azután le lehet forrasztani és alacsony hőmérsékleten, pl. 4 °C hőmérsékleten tárolni, vagy lehet fagyasztva szárítani. Abból a célból, hogy immunitást idézzünk elő maláriára gerinces gazdaszervezetben, a megfelelően kiszerelt vakcina egy vagy több adagját adhatjuk be. Ajánlatos, hogy minden egyes adag 0,1-2 ml, előnyösen 0,2-1 ml, legelőnyösebben 0,5 ml vakcina legyen. A találmány egy további szempontja szerint módszert nyújtunk malária elleni immunitás előidézésére fogékony gerinces gazdaszervezetekben, ez abból áll, hogy egy fentebb meghatározott vakcina hatásos menynyiségét adjuk be a gazdaszervezetbe. A vakcinát bármely hagyományos módon be lehet adni, a vakcina beadási módja magában foglalja az orális beadást és a parenterális (pl. szubkután vagy intramuszkuláris) injekciókat. A kezelés állhat egyetlen adag vakcina beadásából vagy több adag beadásából megfelelő időtartamon át. Az itt következő példák csak szemléltetés céljából vannak és nem arra vannak szánva, hogy korlátozzák a találmány oltalmi körét bármilyen módon 15 1. példa Egy cDNS klón azonosítása a P.195 génből P. falciparum tenyészeteket tartunk fenn és szinkronizálunk, amint ezt Holder és Freeman leírták (1982, fentebb idézett munka), és a sejteket 30-40 órával az újra-megtámadás (invázió) utolsó ciklusa után centrifugálással összegyűjtjük. PBS-ben történő (150 mmól/liter NaCl, 5 mmól/liter KC1 és 10 mmól/liter nátrium-foszfát, pH 7,2) mosás után a sejteket újra szuszpendáljuk a következő oldatban: 50 mmól/liter nátrium-acetát, pH 5,5, 100 mmól/liter NaCl, 1 mmól/liter EDTA és 3%-ig hozzáadott SDS (nátrium-dodecíl-szulfát). Azonos pufferrel kiegyensúlyozott fenol-kloroform (1:1) eleggyel élénk extrahálást hajtunk végre 5 percen át, majd 16000 g-vel centrifugálunk 3 percig. A vizes fázis második extrahálása után a nukleinsavakat etanollal kicsapjuk, centrifugálunk, a szemcséket 4 ml 0,1 mól/literes EDTA-oldat- 10 ban (pH 7,5) feloldjuk és 4 g CsCl-t adunk hozzá. Az RNS-t szilárd formában kiválasztjuk egy 0,1 mól/literes EDTA oldatban levő 95%-os (tömeg/térfogat) CsCl-párnán keresz- 5 tül 150 000 g-nél 16 órán át 25 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással, majd újra oldjuk desztillált vizben és kétszer kicsapjuk etanollal. Az mRNS tisztítását standard módsze- 10 rekkel oligo-dT cellulóz kromatográfiával hajtjuk végre (Maniatis, T., Fritsch, E.F. és Sambrook, J.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York /1982/h Az RNS méret szerinti 15 frakcionálását szacharóz gradiensben végezzük, amint ezt korábban leírtuk /Odink, K.G. és munkatársai: J. Biol. Chem. 256, 1453-1458 /1981/). Egy cDNS könyvtárat hozunk létre standard eljárást alkalmazva (Maniatis és 20 munkatársai /1982/), fentebb idézett munka). A cDNS-t 50 pl reakciókeverékben szintetizáljuk 90 percen át 42 °C hőmérsékleten, a reakciókeverék 6 Mg poli A + RNS-t, 5 Mg oligo-dT(i2-i8)-at, 1 mraól/litert minden 25 egyes nukleozid trifoszfátból, 0,1 mól/liter TrisHCl-t (pH 8,3), 10 mmól/liter MgCk-t, 140 mmól/liter KCl-t, 10,mmól/liter DTT-t és 30 egység AMV reverz transzkriptázt tartalmaz. 30 A második szál szintézise 16 órán át 15 °C hőmérsékleten történik 0,1 ml olyan oldatban, amely 0,1 mól/liter HEPES puffert (pH 6,9), 10 mmól/liter MgClz-t, 2,5 mmól/liter DTT-t, 70 mmól/liter KCl-t, 0,5 mmől/litert 35 mindegyik nukleozid trifoszfátból, ás 50 egység E. coli DNS polimeráz nagy fragmenst tartalmaz. SÍ nukleázzal végzett emésztés után 5 Mg DNS-t nyerünk ki és 0,5 Mg~ot iktatunk be pUC8 (Viera, J. és Messing, J.: 40 Gene, 19, 259-268 /1982/) PstI helyére homopolimer G-C farokkèpzèssel. E. coli HB101-et (Bolivar, F. és mtársai, Methods Enzymol, 68, 245) használunk a transzformáláshoz. 3000 rekombinánst hordozó replika szűrőt vizsgá- 45 lünk át ï-^P-ATP polinukleotid kinázzal jelzett 335 mRNS-el, amelyekről korábban kimutattuk in vitro transzlációval, hogy dúsitva vannak P.195-öt kódoló mRNS-sel (Odink és munkatársai, 1984). A vizsgáló mintával 60 50 rekombináns mintát mutatunk ki, ezek közűi 12 erős jelet ad. Bemetszéssel átfordított (nick-transzlációs) beiktatások kereszt-hibridizálásának alapján 6 alcsoportot képzünk a 12 rekombinánsból. Annak a feltételezésnek 55 az alapján, hogy ezek a rekombináns vizsgáló minták a P. 195-höz szolgáló DNS szekvencia részeit képviselik, ezeket a P. falciparum mRNS teljes extraktumából származó nem kevesebb, mint 5300 bázis hosszúságú mRNS- 60 -hez hibridizálhatjuk; ez a minimálisan becsült hossz, amely ahhoz szükséges, hogy kódoljon egy kb 195 000 molekulasúlyú fehérjét. Mindegyik csoport egy tagját jelezzük nick-transzlációval, és ezeket felhasznál- 65 juk vizsgáló mintaként, P.falciparum RNS
