200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
21 . HU 200794 B 22 gélről elektromos úton eluáljuk és szekvenciájukat meghatározzuk. 2. ) Didezoxi-szekvenciaelemzés A DNS templátokat az M13mp8 egyszálú fág klónozó/szekvencia meghatározó vektorban levő beiktatás fragmenseinek szubklónozásával készitjük (Messing és Viera, 1982, fentebb idézett munka). A szekvencia-elemzést szintetikus univerzális prímért (mintát) (Celltech) és [3SS]-dATPoCS-t (Amersham International) alkalmazva hajtjuk végre, amint ezt Sanger és munkatársai leírták (1977, fentebb idézett munka). Két alapvető stratégiát alkalmazunk a fajlagos fragmensek szekvencia-elemzésére. Az elsőben speciális restrikciós fragmenseket (amelyeket Rsal-el, Rsal- AhaIII-al és Taql-el végzett emésztéssel állítunk elő) elektromos eluálással tisztítunk, és ahol szükséges, a lépcsős végeket tompává tesszük, Klenow DNS polimeráz I fragmenst alkalmazva. Azokat a fragmenseket, amelyeket nehéz klónozni vagy szekvenciájukat elemezni a fenti módszerrel, Bal 31-el kezeljük (Maniatis és munkatársai, 1982). A feltételeket (DNS- és enzimkoncentráció) úgy választjuk meg, hogy 100-150 bp-s DNS-t távolítunk el a fragmens mindkét végéről 1 percen belül 30. °C hőmérsékleten. Egy időtartamon át emésztve egy sor átfedő fragmenst nyerünk. A Bal 31-el kezelt DNS-t DNS polimeráz I Klenow-fragmenssel helyreállítjuk. A DNS-t foszfatázzal kezelt, Smal-el emésztett M13mp8-al (Amersham) ligáljuk, és átfertőzzük JM103-ba vagy JM101-be (Messing, J. és munkatársai: Nucl. Acid Res. 9, 309 /1981/). Templát DNS-t készítünk standard módszerek szerint. Ahol lehetséges, minden egyes klón mindkét végéről nyerünk szekvenciát. Az egyes kiónok szekvenciájának átfedésével nyert teljes szekvencia az 1. ábrában van bemutatva. A szekvencia meghatározásához használt kiónokat a DNS szekvenciából nyert restrikciós térkép alatt mutatjuk be a 2. ábrában. 6. példa A tenyészet felülúszóból nyert 83 000 molekulatömegű fragmens tisztítása és a részleges aminosav-szekvencia meghatározása Az in vitro tenyésztett P. falciparumból (az 1. példában leírva) a felülúszót kinyerjük és 10 000 g-vel centrifugáljuk 5 percen át, hogy eltávolítsuk a sejt-eredetű törmelékeket. Minden 100 ml tenyészet-felülúszóhoz 1 ml 1 mól/liter Trist, 100 mmól/liter EDTA-t és 100 mmól/liter EGTA-t tartalmazó oldatot, 1 ml 100 mmól/literes PMSF oldatot, 1 ml 0,5 mól/literes jódacetamid-oldatot, 1 ml 10 mmól/literes TLCK oldatot és 0,5 g nátrium-dezoxikolátot adunk. A pH-t 8,2-re állítjuk be HCl-el, majd a mintát centrifugáljuk 100 000 g-vel 45 percen át. Centrifugálás után a felülúszót 10 ml 89.1-Sepharose antitest oszlopra visszük (az oszlopot úgy készítve, ahogyan Holder és Freeman leírták (1984 b), fentebb idézett munka), amely oszlopot előzőleg kiegyensúlyozó pufferral egyensúlyoztunk ki (kiegyensúlyozó puffer: 10 mmól/liter Tris-HCl (pH 8,2), amely 1 mmól/liter EDTA-t, 1 mmól/liter EGTA-t és 0,5% (súly/térf.) nátrium-dezoxikolátot tartalmaz). Miután az oszlopot alaposan átmostuk a kiegyensúlyozó pufferral, az oszlopon visszamaradt anyagot 5 mmól/literes dietil-amin HCl-el (pH 11,5) eluáljuk, amely eluáló oldat 0,5% (súly/térf.) nátrium-dezoxikolátot is tartalmaz. Az eluátumot ultraszüréssel koncentráljuk, Amicon XM50 szűrőt alkalmazva, és pH 8,2-re beállítjuk. Az eluátumban levő fő polipeptid a 83 000 molekulasúlyú polipeptid, és ez az egyetlen alkotórész, amely a 89.1 monoklonális antitesttel, polivalens nyúl anti-P.195 szérummal vagy humán P. falciparum immun szérummal reagál Western foltképzésen. A készítményben a fő szennyező anyag az IgG, amelyet a koncentrált eluátumból egy Protein 1-Sepharose oszlopon átengedéssel távolítunk el, az oszlop mérete 0,9 x 10 cm (Pharmacia Fine Chemicals), és a fentiek szerint van kiegyensúlyozva. A vissza nem tartott anyagot, amely már IgG-től mentes, őszszegyűjtjük. Szilárd guanidium-kloridot adunk hozzá, amig tiszta oldatot nem nyerünk, majd a fehérjét redukáljuk és S-karboximetilezzük (Waxdal, M.J. és munkatársai: Biochemistry, 7, 1959-1966 /1968/). A redukált és S-karboxilezett 83 000 molekulatömegű polipeptidet végül egy Sephacryl 5300 oszlopon (Pharamacia Fine Chemicals, Svédország) átbocsátással tisztítjuk, amely oszlopot 10 mmól/literes Tris-HCl-el (pH 8,2) egyensúlyozzuk ki, ez az oldat 1 mmól/liter EDTA-t, 1 mmól/liter EGTA-t és 6 mól/liter guanidium-kloridot is tartalmaz. Frakciókat vizsgálunk át spektrófotometriával 280 nm-nél, és alikvotok SDS-PAGE elemzésével, és azokat, amelyek a 83 000 molekulatömegű anyagot tartalmazzák, összegyűjtjük. Erőteljes dialízis után vízzel és 5%-oe (térf./térf.) hangyasavval szemben a mintát fagyasztva szárítjuk az automatikus szekvencia-elemző alkalmazása előtt kis térfogat 5%-os hangyasavban. A fehérjét 20 ciklus automatizált Ed man-le bontásnak tesszük ki Beckman 890 C szekvenciaelemzőben, amely Sequamat P6 automatikus konverterrel és Sequamat SC-S10 programra szabályozóval van ellátva, az alkalmazott Programm a 0,33 M Quadrol programm, amint ezt Baccanari, D.P. és munkatársai leírták (J. Biol. Chem. 259, 12291-12298 /1984/). Az aminosavak kibocsátott fenil-tio-hidantoin származékait azonosítjuk fordított fázisú nagynyomású folyakékkromatográfiával (HPLC) és igazoljuk visszaforditott (back) hidrolízissel (Baccanari és munkatársai /1984/, fentebb 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
