200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
14 13 HU 200793 B ezeknek a transzformánsoknak mindegyik sejtjéből izoláljuk a Birnboim-Doly alkáli módszerrel [Bimbóim, H.C. és Doly, J.: Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)]. Majd a plazmid DNS-ben a beiktatott részt kihasítjuk, a PstI 5 restrikciós enzimet használva. Az izolált plazmidok közül az egyetlent, amely a leghosszabb beiktatott fragmenst tartalmazza, szelektáljuk és pILOT 135-8-nak nevezzük el. Ennek a plazmidnak a restrikciós enzimes 10 térképét mutatja az 1. ábra. Az ebbe a pILOT 135-8-ba beiktatott cDNS primer szerkezetét (bázis-szekvenciáját) a didezoxi-nukleotid módszerrel és a Maxam-Gilbert módszerrel határozzuk meg. Az 15 igy meghatározott primer szerkezetet mutatja be a 2. ábra. Az ezzel a bázis-szekvenciával meghatározott peptid 153 aminosavból áll, kezdve a szintézist start szignáljával (64-66 ATG). Ezekből az N-terminálisból eredő 20 20 aminosavat tekintjük annak, amely szignál peptidet alkothatja. A fenti primer szerkezet megmutatja, hogy ez a plazmid rendelkezik a humán IL-2 fehérjét kódoló teljes bázis szekvenciával. Ez a tény azt jelzi, hogy az 25 említett plazmidba beiktatott gén beiktatása egy megfelelő kifejeződést elősegítő plazmidba az IL-2 fehérje tetszés szerinti polipeptid részének termeléséhez vezethet. 30 2. referencia példa Az 1. referencia-példában nyert pILOT 135-8 plazmidot Hgi Al restrikciós enzimmel elhasitjuk. Az így nyert 1294 bp hosszúságú 35 DNS fragmenst, amely az IL-2 gént- tartalmazza, T4 DNS polimerázzal kezeljük, CGATA ATG GCA Clal kapcsolóval egyesitjük, amely tartalmazza az alaninhoz szolgáló GCA kodont és a metioninhoz szolgáló ATG kodont, és a 40 terméket dal-el és Pstl-el kezeljük, ezt követi a beiktatás a ptrp 771-be (Nudeic Acids Research 11, 3581-3591, 1983) a CM-Psü helynél. Az igy nyert kifejeződést elősegítő plazmidot pTF4-nek nevezzük (4. ábra). 45 3. referencia példa Escherichia coli DHl-et transzformálunk 50 a 2. referencia-példában nyert pTF4 plazmiddal . Cohen és munkatársainak módszerével összhangban [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)], hogy olyan transzformánst nyerjünk (Escherichia coli DH1 (pTF4), amely 55 az említett plazmidot hordozza. 1. példa 60 I. E. coli DH1 (pTF4-et) amelyet a 3. referencia-példában nyertünk) inokulálunk 50 ml folyékony tápközegben (pH 7,0), amely IX Bacto triptont (Difco Laboratories! Amerikai Egyesült Államok), 0,5% Bacto élesztőki- 65 vonatot (Difco Laboratories, Amerikai Egyesült Államok), 0,5% nátrium-kloridot és 7 pg/ml tetraciklint tartalmaz, 250 ml-es Erlenmayer lombikba helyezve. 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át lengő rotoron történt inkubálás után a tenyésztő közeget 5 literes széles szájú fermentorba visszük át, amely 2,5 liter M 9-es tápközeget tartalmaz, ennek a tápközegnek az összetétele: 0,5% kazanpno-sav, 0,5% glükóz és 7 pg/ml tetraciklin. Az inkubálást ezután levegőztetés és kevertetés mellett 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 4 órán át, majd. 25 pg/ml 3-ß-indolil-akrilsav hozzáadása után további 4 órán át. Az igy nyert 2,5 liternyi tenyészléböl a sejteket centrifugálással kinyerjük, és -80 °C hőmérsékletre lefagyasztjuk és tároljuk. II. Az 1. példa (I) részében nyert fa-: gyasztva tárolt sejteket (12,1 g) 100 ml extrahálószerben szuszpendéljuk (pH 7,0), amely 7 mól/liter guanidin hidrokloridot és 0,1 mól/liter Trisz. HCl-t tartalmaz, a szuszpenziót 4 °C hőmérsékleten 1 órán át szuszpendáljuk és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen át centrifugáljuk, igy 93 ml felülúszót nyerünk. III. Elkülönítve különböző eljárásokat hajtunk végre, hogy kivonjuk az 1. példa (I) része szerinti módszerrel nyert E. coli DHl/pTF4 transzformáns sejtekből az IL-2-t a megfelelő extrakciós hatásosságok összehasonlítása érdekében. A lizozim-EDTA módszerben 2 g, az 1. példa I. része szerint nyert E. coli DHl/pTF4 sejtet 16 ml pH 7,0 értékű, 0,1 mól/liter Trisz.HCl-t, 10 mmól/liter EDTA-t és 250 rag/1 lizozimot tartalmazó oldattal keverünk össze, a keveréket 4 °C hőmérsékleten 1 órán ét, majd 37 °C hőmérsékleten 5 percen ét kevertetjük, és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen át centrifugáljuk. Az ultrahangos ‘feltárási (szonikációs) módszerben 2 g fentebb említett sejtet 16 ml pH 7,0 értékű, 0,1 mól/liter Trisz.HCl-t tartalmazó oldatban szuszpendálunk, a szuszpenziót ultrahanggal kezeljük 0 °C hőmérsékleten 5. percen át, és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen ét centrifugáljuk. A guandini.HCl módszerben 2 g fentebb említett sejtet 16 ml pH 7,0 értékű, 0,1 mól/liter Trisz.HCl-t és 2 mól/liter vagy 4 mól/liter vagy 7 .mól/liter guanidin.HCl-t tartalmazó oldattal összekeverünk, a keveré-két 4 °C hőmérsékleten 1 órán ét kevertetjük és a lizátumot 28 000 Xg-nél 20 percen át centrifugáljuk. Az így nyert félülúszó folyadékokat alkalmazzuk a fehérje-koncentráció és az IL-2 aktivitás méréséhez. Az eredményeket a 2. táblázat szemlélteti. 9
