200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására

15 HU 200793 B 1«

2. TÁBLÁZAT. Az IL-2 extrahálása

Extrakciós

eljárás

Fehérje-koncentráció

(mg/rol)

IL-2 aktivitás az extraktumban (egység/ml)

Relatív

hányados

(X)

Lizozim-EDTA

5,40

3,3

0,02

Ultrahangos kezelés

6,54

2,2

0,01

2 mól/liter Gu.HCl

2,60

46

0,2

4 mól/liter Gu.HCl

4,12

144

0,8

7 mól/liter Gu.HCl

7,22

19100 .

100

Gu.HCl = guanidin hidroklorid

IV. Az 1. példa II. része szerint nyert felülúszó folyadékot dializáljuk 0,01 mól/liter Trisz.HCl pufferral (pH 8,5) szemben, majd centrifugáljuk 19 000 Xg-nél 10 percen át, igy 94 ml dializált felülúszó .folyadékot nyerünk. Ezt alkalmazzuk egy DE 52 (DEAE-cellulóz, Whatman, Nagy-Britannia) oszlophoz (50 ml térfogatú), amelyet 0,01 mól/literes Trisz.HCl pufferrel egyensúlyoztunk ki, a fehérjék adszorpciója érdekében. A fehérjéket lineáris "NaCl koncentráció-gradienssel (0- -0,15 mól/liter NaCl, 1 liter) eluáljuk. Az aktív frakciókat (53 ml) 4,8 ml-re koncentráljuk YM-5 membránt (Amican, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazva, majd 0,1 mól/liter Trisz.HCl (pH 8,0)" - 1 mól/liter NaCl pufferral kiegyensúlyozott 500 ml térfogatú Sephacryl S-200 (Pharmacia, Svédország) oszlopot alkalmazva gélszűrésnek vetjük alá. Az igy nyert aktiv frakciókat (28 ml) 2,5 ml-re koncentráljuk YM-5 membrán alkalmazásával. Ezt a koncentrátumot alkalmazzuk Ultrapore RPSC (Altex, Amerikai Egyesült Államok) oszlopra az adszorpcióhoz, és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát hajtunk végre, mozgó fázisként trifluor-ecetsav-acetonitril rendszert alkalmazva.

Az alkalmazott körülmények a kővetkezők: oszlop: Ultrapore RPSC (4,6 x 75 mm); oszlop hőmérséklet: 30 °C; A oldat: 0,1% trifluor-ecetsav-99,9% viz; B oldat: 0,1% trifluor-ecetsav-99,9% acetonitril; elúciós program:

0. perc (68% A + 32% B) - 25. perc (55% A + + 45% B) - 35. perc (45% A + 55% B) - 45. perc (30% A + 70% B) - 48. perc (100% B); elúciós sebesség: 0,8 ml/perc; kimutatási hullámhossz: 230 nm. Aktiv frakciót gyűjtünk össze mintegy 39 perc retenciós időnél. így 10 ml oldatot nyerünk, amely 0,53 mg nem glikozilezett humán IL-2 fehérjét tartalmaz [fajlagos aktivitás: 30000 egység/mg; aktivitás-visszanyerés a kiindulási' anyagból: 30,6%; a fehérje tisztasága: 99% (SDS-poliakrilamid gél elektroferogramon végrehajtott denzitometriás méréssel meghatározva)].

A fenti oldat liofilezése fehér port ad. A por fajlagos aktivitása 26 000 egység/mg.

20 V. Az 1. példa IV. része szerint nyert humán IL-2 fehérjét a következő tulajdonságokra

vizsgáljuk:

(1) Homogenitás:

A festés Coomassie Brilliant Blue festék- 25 kel az SDS-poliakrilamid gól elektroforézis után Laemmli és munkatársai [Nature, 227, 680 (1970)] szerint csak az említett humán IL-2 fehérje egyetlen csikját mutatja" ki '(lásd 5. ábra). A kötés elhelyezkedése válto- 30 zatlanul marad redukáló körülmények között éppen úgy, mint nem redukáló körülmények' között.

(2) Molekulatömeg

Az említett humán IL-2 fehérje molekulatőme- 35 gét kb. 15 000 daltonnak számoljuk ki az SDS-poliakrilamid gél elelktroforézis eredményei alapján (lásd 5. ábra)

(3) Aminosav-összetétel

Az említett humán IL-2 fehérje 20 /ug-os 40 adagját egy üveg kémcsőbe helyezzük hidrolízis céljából, 4% tioglikolsavat tartalmazó, állandóban forrásban levő sósavat adunk hozzá, majd a csövet vákuumban leforrasztjuk és hidrolízist végzünk 110 °C hőmérsékleten 24, 45 48 és 72 órán át. Hidrolízis után a csövet felnyitjuk, a sósavat csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a maradékot 0,02 n sósavban feloldjuk, majd Hitachi 835 modell aminosav-analizátort alkalmazva aminosav analízisnek 50 vetjük alá. A cisztin és cisztein meghatározásához az említett humán IL-2 fehérjét perhang yasavval oxidáljuk Hire módszere szerint [Methods in Enzymol., 11, 59 (1967)], fezt követi a hidrolízis állandóan forrásban levő só— 55 savban csökkentett nyomáson 24 órán át. A hidrolizátumot ciszteinsav meghatározásnak vetjük /ilá, aminosav analizátort alkalmazva. A fenti aminosav-anallzisekkel nyert eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. Az 60 eredmények három érték átlagát jelentik .minden esetben, a három értéket a 24, 48 és 72 órás hidrolízis után nyerjük; a szerin és a treonin kivételt képez, ezeket a hidrolízis zéró időpontjára való extrapolálással határoz- 65 zuk meg.

10