200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
3 HU 200793 B 4 kettős szálú DNS-t szintetizálunk. A DNS-t egy plazmidba iktatjuk, a rekombináns plazmidot pl. egy Escherichia coli vagy Bacillus subtilis törzs transzformálásához használjuk fel, és a cDNS-tartalmú plazmidot klónozzuk, ilyen módon állíthatunk elő egy humán IL-2-t kódoló kettős szálú DNS-t. Még részletesebben a humán IL-2-t kódoló mRNS-t, amelyet a találmány gyakorlati kivitelében akarunk alkalmazni, Hinuma és munkatársai módszere szerint állíthatjuk elő [Biochemical and Biophysical Research Communications, 109, 363 (1982)]. Az igy nyert humán IL-2 mRNS-el, mint templáttal cDNS-t szintetizálunk ismert módon reverz transzkriptáz alkalmazásával, és .a cDNS-t átalakítjuk kettős szálú DNS-é [Maniatis, T. és munkatársai: Cell, 8, 163 (1976); Land, H. és munkatársai: Nucleic Acids Research, 9, 2251 (1981)]. Ezt a DNS-t pl. a pBR322 plazmidba iktatjuk be a Psü restrikciós endonukleáz hasítási helynél pl. a dG-dC homopolimer ligációs módszerrel (Nelson, T.S.: Methods in Enzimology, 68, 41 (1979)]. Ezután egy, a humán IL-2 egy részlete aminosav-szekvenciájának megfelelő bázis-szekvenciával rendelkező oligonukleotidot szintetizálunk pl. kémiai úton; majd ^P-vel jelezzük. Ezt, mint mintát használva a kivánt kiónt a tetraciklin- vagy ampicillin-rezisztens transzfor.mánsok közül az ismert telephibridizációs módszerrel'kiszelektáljuk [Grunstein, M. és Hogness, D.S.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA,' 72, 3961 (1975); Alwine, J.C. és munkatársai: Methods in Enzimology, 68, 220 (1979). A humán IL-2 gén jelenlétét- a Maxam-Gilbert módszerrel [Maxam, A.M. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)], vagy az M 13 fágot alkalmazó dinukleotid szintetikus lánc végpont módszerrel [Messing, J. és munka-' társai: Nucleic Acid Research, 9, 309 (1981)] a fenti hibridizációs módszerben pozitívan reagáló klónokból származó DNS bázisszekvenciájának meghatározásával igazoljuk. Majd a humán IL-2 gén egészét vagy egy részét a nyert kiónból kimetsszük és egy plazmidba iktatjuk be az alkalmas promoterrel és az SD (Shine és Dalgarno) bázis-szekvenciától lefelé a megfelelő gazdaszervezetbe ez után történő bevezetés érdekében. Többek között a trp promoter alkalmazása előnyös promoterként. Gazdaszervezetként többek között egy Escherichia coli törzs (pl. 294. törzs, DH1 törzs, N4830 törzs) alkalmazható előnyösen. Az Escherichia coli 294 törzs [Beckman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73, 4174 (1976)], E. coli DH1 törzs [Selson, M.E. és munkatársai, Nature, 217, 1110 (1968) és E. coli N 4830 törzs (Cell, 25, 713 (1981)] ismert törzsek. Az ilyen gazdatörzsek transzformálását a DNS-el ismert módszerrel lehet végrehajtani [Cohen, S.N. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)]. Áz igy nyert gazdaszervezetet ismert közegekben tenyésztjük, mint pl. a glükózt és kazamino-savat tartalmazó M9 tápközeg (Miller, J.: Experiments is Molecular Genetics (Kísérletek a molekuláris genetikában) 431-433 oldal [Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Azokban az esetekben, ahol trp promotert használunk, valamilyen ágenst, pl. 3-ß-indolil-akrilsavat adhatunk az említett promoter hatásosságának növelésére. A tenyésztést általában 15-43 °C között hajtjuk végre 3-24 óra alatt, levegőztetve éB kevertetve olyan mértékben, amennyire szükséges. Abban az esetben, ha A PL promotert használunk, a tenyésztést előnyös viszonylag alacsony hőmérsékleten végrehajtani, 30 és 36 °C között növesztve a transzformánst, majd 37 és 42 °C között folytatni a transzformánsban levő represszor inaktiválása érdekében és igy hatásosan kifejezni a humán IL-2-t kódoló DNS-t. Az igy keletkezett humán IL-2-t meg kell határozni IL-2-függÖ sejtvonalat alkamazva. Mivel a humán IL-2-ről ismeretes, hogy elősegíti a patkány-, egér- humán vagy más. IL-2-függő sejtek növekedését, [Immunological Reviews, 51, -257 (1980)]; hem csupán a humán IL-2-függő sejtvonalak, hanem a patkány- vagy egér IL-2-függő sejtvonalak is alkalmazhatók [Journal of Immunology, 130, 981 és 988 (1983)]. Főleg az egér IL-2-függö .sejtvonalakat lehet stabilan fenntartani hosszú időtartamon át 'altenyészetekben úgy, hogy alkalmazása nagyon jól reprodukálható vizsgálati eredményeket adhat. A humán IL-2 találmány szerinti kinyerésében a tenyésztett sejtekből a sejteket tenyésztés után ismert módon kinyerjük, Sebér je-denaturáló szer, pl. guanidin ásványi savas sói (pl. hidroklorid, nitrát, szulfát) oldatában szuszpendáljuk és a szuszpenziót hidegben keverjük, majd centrifugáljuk, miáltal IL-2 tartalmú felülúszót nyerünk, vagy egy másik módszer szerint a kinyert sejteket pufferben szuszpendáljuk, ultrahang kezeléssel feltárjuk, lizozimmel kezeljük és/vagy fagyasztjuk és felengédtetjük, végül centrifugáljuk, igy nyerjük az IL-2 tartalmú felülúszót. Bármiféle más alkalmas módszer is használható. Az IL-2 izolálását a fenti felülúszóból és az IL-2 ezt követő tisztítását végre lehet hajtani az ismert elkülönítési és tisztítási módszerek álkalmas kombinációjával. Az ilyen ismert elkülönítési és tisztítási módszerek lehetnek többek között olyan módszerek, amelyek az oldhatósági különbségeket használják ki, mint pl. a kisózási módázer és az oldószeres kicsapási módszer; olyanok, amelyek nagyrészt a molekulatömeg különbségeket használják ki, mint pl. a dialízis, ultraszűrés, gélszűrés és SDS(nátrium-D0DECIL-6Zulfát)-poliakrilamid-gél elektroforézis; olyanok, amelyek a töltésekben levő különbségeket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
