200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
6 5 HU 200793 B használják ki, mint pl. az ioncserélő kromatográfiai olyanok, amelyek a fajlagos affinitásokat használják ki, mint pl. az affinitás-kromatográfia; olyanok, amelyek a hidrofóbitási különbségeket használják ki, mint pl. a fordított fázisú nagy teljesítményű folyadék kromatográfiai vagy olyanok, amelyek az izoelektromos pontok közötti különbségeket használják ki, mint pl. az izoelektromos fókuszálás. Mivel a humán IL-2 fehérje nagyon hidrofób, a hidrofób oszlopkromatográfia, főleg a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia fordított fázisú oszlopot használva, nagyon hatásos a fenti fehérje tisztításában. Így pl. a humán IL-2-t kódoló gént hordozó Escherichia coli törzs tenyésztésével nyert sejteket egy oldatban szuszpendáljuk, amely előnyösen egy fehérje-denaturáló szer, mint pl. guanidin hidroklorid pufferja (2 mól/liter és 8 mól/liter, előnyösen 6 mól/liter és 8 mól/liter közti koncentrációban), majd a szuszpenziót kevertetjük előnyösen 0 és 5 °C közötti hőmérsékleten 0,5-3 órán át, majd centrifugáljuk. Az így összegyűjtött felülúszót, akár ebben a formában, akár ultraszűrő berendezést vagy hasonlót használó koncentrálás után, dialízisnek vetjük alá. Az igy nyert csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót pl. dietil-amino-etil-cellulózt [pl. DE cellulóz (Whatman, Nagy-Britannia) oszlopot] alkalmazó anioncseréió kromatográfiának vetjük alá, majd az aktív frakciót összegyűjtjük. Majd, miután ultraszűrő berendezést használva koncentráltuk, az aktiv frakciót N,N’-metilén-bisz»krilamid-keresztkötésű allil-dextrént, pl. Sephacryl S-200 (Pharmacia, Svédország) oszlopot, vagy hasonlót használó gélszűrésnek vetjük alá. Az összegyűjtött aktív frakciókat ez után a korábban említett nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának vetjük alá. Ezen a módon nyerhetjük a találmány szerinti nem glükozilezett humán IL-2- -t. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában használandó fordított fázisú rendszerként többek között az alkilezett (Ci-w) szilánokkal borított gyanták hatásosan alkalmazhatók. Eluáló szerként valamely Ci-s szénatomszámú alkanol (pl. etanol, propanol) vagy acetonitril alkalmazható előnyösen és az eluálószer pH-ja 1,5-8, előnyösen 1,5-4 között lehet. Az eluálás sebessége előnyösen 0,1- y-100 ml/perc között van. Az igy nyert humán IL-2 fehérjét por formájúvá lehet alakítani liofilezéssel, ha szükséges. A liofilezés alkalmával stabilizálószert, pl. szorbitot, mannitot, dextrózt, maltózt, glicerint vagy humán szérum-albumint (HSA) lehet adni. Amikor az IL-2 aktivitást mérjük, indexként az IL-2-függö egér-sejtek radioaktív timidin felvételt alkalmazva, a jelen találmány szerint nyert IL-2 fehérje nem kevesebb, mint 1 x 104 egység/mg fajlagos aktivitást mutat. A találmánnyal összhangban lehet nyerni nagyon tiszta, nem glükozilezett humán IL-2 fehérjét is, amely nem kevesebb, mint 2 x 104 egység/mg fajlagos aktivitással 5 rendelkezik, de felmehet 4 x 104 egység/mg-ra is. Az előbb említett IL-2 aktivitási egységet a következő módon számíthatjuk ki. IL-2 tartalmú mintát adunk egy olyan 10 tápközeghez, amely az IL-2 koncentrációtól függően növekvő egér-sejtvonal sejtjeit tartalmazza, és az egész keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át 5% CO2 jelenlétében, és az említett sejtvonal nö- 15 vekedését triciummal jelzett timidint alkalmazva meghatározzuk. Az egységekben való aktivitás kiszámításához a szóban forgó mintában, standard IL-2-t (1 egység/ml) mindig alkalmazunk összehasonlításként, és az egy- 20 ségben megadott aktivitást a minta és a standard közti aktivitás hányadosából számítjuk ki. Részletesebben kifejtve, egy IL-2-függö egér-sejtvonal (NKC3) [Hinuma és munkatár- 25 sai: Biochem. Biophys. Rés. Commun., 109, 363 (1982)], amelyet IL-2 tartalmú kondicionált tápközeggel kiegészített 20X hozzáadott FCS (borjúembrió szérum) tartalmú tápkőzegben 37 °C hőmérsékleten 5% CO2 jelenlétében te- 30 nyésztéssel tartottunk fenn, sejtjeit kétszer mossuk szérummentes RPMI 1640 tápközeggel és újból szuszpendáljuk 20% hozzáadott FCS tartalmú tápközegben 6 x 105 sejt/ml sejtsűrűségre. 35 Az IL-2-tartalmú mintákat 50 jul-es adagokban egy 96 üreges laposfenekű mikrotitráló lemez (Nunc, Dánia) első sorában levő üregekre osztjuk el. A 20X hozzáadott FCS tartalmú RPMI 1640 tápközegből 50 jul-es ada- 40 gokat használva, kétszeres hígítási sort készítünk a 12. sorig. Ez után a fenti NKC 3 sejtszuszpenziót osztjuk szét 50 pl-es adagokban minden egyes üregbe, ezt követi egy 24 órás inkubálás 5X CO2 jelenlétében 37 °G 45 hőmérsékleten. Az inkubáláB 20. órája után 1 mCí triciummal jelzett timidint (Amersham, Nagy-Britannia) adunk minden egyes üregbe. Az inkubálás további négy órája után a sejteket egy üvegszűrőbe kinyerjük egy sejt- 50 -arató berendezést (Flow, Amerikai Egyesült Államok) használva, és'megmérjük a triciummal jelzett timidin felvételét, folyadék szcintillációs számlálót alkalmazva. A fenti meghatározás kivitelezésében standard IL-2 mintát 55 is kiteszünk azonos eljárásnak a mérendő mintákkal együtt, és a triciummal jelzett timidin felvételét meghatározzuk. Az aktivitás kiszámítását egységekben a probit módszerrel hajtjuk végre, a Journal 60 of Immunologyban megjelent közlemény szerint [120, 2027 (1978)]. így a standard IL-2 minta hígítási sorozatban nyert maximális timidin-felvételt tekintjük 100X-nak, és a timidin-felvétel százalékát X minden egyes hígi— 65 tási stádiumnál kiszámítjuk. Az így nyert ér-5
