200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
1 HU 200793 B 2 A bejelentés tárgya eljárás humán interleukin-2 - fehér je előállítására genetikai manipulációs technika segítségével. Az interleukin-2 [amelyet T sejt növekedési faktornak is neveznek (TCGF); ezután ezt IL-^-ként fogjuk rövidíteni] egy olyan limfokin, amelyet a T sejtek produkálnak lektinnel vagy alloantigénnel történt stimulálásra [lásd pl. Science, 193, 1007 (1976); Immunological Reviews, 51, 257 (1980)]. Az IL-2 lehetővé teszi a T sejtek hosszú időn át tenyésztését, in vitro növesztésüket engedve meg, miközben funkcióik megmaradnak. Ezentúl az IL-2 állítólag elősegíti a timusz (csecsemőmirigy) sejtek mitogén reakcióját (kostimulátor), helyreállítja a lépsejtek T-sejt-függó antigénjei elleni antitest-termelést meztelen egérben (T-sejt helyettesítő faktor), vagy elősegíti a killer (gyilkos) sejtek differenciálódását és sejtburjánzását (killer segítő faktor) (The Journal of Immunology, 123, 2928 (1979); Immunological Reviews, 51, 257 (1980)]. A killer T sejt kiónokat, a kisegítő T sejt kiónokat, továbbá a természetes killer sejt kiónokat eddig is nagy szómban nyerték az IL-2 hasznosítása útján [pl. Nature, 268, 154 (1977); The Journal of Immunology, 130, 981 (1983)]. A T sejtekben vagy a természetes killer sejt klónozásban való ilyen közvetlen alkalmazáson túl az IL-2-t lehet használni a speciális antigénekre fajlagos killer T sejtek szelektív növesztéséhez, pl. olyan killer T sejtekhez, amelyek felismerik a tumor antigént és elroncsolják a tumort in vitro. Az ilyen módon növesztett fajlagos killer T sejtek injektálásával egy állatba, lehetséges gátolni és megelőzni a tumor növekedését [The Journal of Immunology, 125, 1904 (1980)]. Az is ismeretes, hogy az IL-2 indukálja az IFN-ü termelését (The Journal of Immunology, 130, 1784 (1983), és hogy az IL-2 aktiválja a természetes killer sejteket (The Journal of Immunology, 130, 1970 (1983)]. A fenti kísérleti tények azt sugallják, hogy az IL-2 valószínűleg hasznos lehet tumorellenes szerként. Az IL-2-ről ismeretes, hogy helyreállítja a segítő T sejt funkcióit meztelen egérben, amelyben hiányzik a csecsemőmirigy-funkció. [European Journal of Immunology, 10, 719 (1980)] vagy helyreállítja a homológ sejtek elleni killer T sejtek in*dukcióját [Nature, 284, 278 (1980)] és ennél fogva az IL-2-ről elvárható, hogy hasznos lesz az immun-rendszert elnyomó betegségek kezelésében. Az IL-2 nagy mennyiségű termelése azonban mindeddig nehéz volt, úgy hogy ennek klinikai alkalmazása a jelen ideig nem lehetséges. Következésképpen egy olyan technikára, amely lehetőséget nyújt nagy mértékben tisztított IL-2 előállítására nagy mennyiségben, könnyű és egyszerű módon és kis költséggel, nagyon várnak. Taniguchi és munkatársai a Jurkat humán T sejt leukémia vonalból, mint kiindulási anyagból izolált IL-2 mRNS-t használva klónozták a humán IL-2 gént, közölték a humán IL-2 fehérje aminosav-szekvenciáját, amint ebből kikövetkeztették, és a géneket COS-7 sejtekben kifejezték [Nature, 302, 305 (1983)]. Később Devos és munkatársai közölték, hogy a humán lépsejteredetű IL*2 gént klónozták és Escherichia coli-ban kifejezték [Nucleic Acids Research, 11, 4307 (1983)]. Mindamellett egy IL-2 szerű, vegyület jelenlétét csak feltételezték azon az alapon, hogy TCGF aktivitást mutattak ki. Nincsen olyan közlemény, amely arról számolna be, hogy egy humán IL-2 kódoló DNS-t hordozó transzformáns által termelt humán IL-2 fehérjét valóban izolálták volna tisztított formában. A 91.539 sz. európai közrebocsátási irat humán IL-2 géntechnológiai előállítását ismerteti, a kapott fehérje tisztasága azonban nem kielégítő. A jelen feltalálók intenzív kutatásokat végeztek, hogy. megkíséreljenek olyan technikát kifejleszteni, amellyel a kívánt IL-2 fehérjét lehet nyerni a humán IL-2 gén klónozása útján, a gén-manipulációs .technikát alkalmazva, a nyert rekombináns DNS molekulát egy gazdaszervezetbe bevezetve, a humán IL-2 gént az említett, gazdaszervezetben kifejezve; ennek eredményeképpen alapjában véve tiszta, nem glükozilált humán IL-2 fehérje előállításéra szolgáló módszert hozhattak létre, és teljessé tehették a jelen találmány szerinti eljárást. igy a jelen találmány alapjában véve tiszta, nem glükozilált humán IL-2 fehérjét szolgáltat, valamint egy módszert az említett humán IL-2 fehérje előállítására, amely módszer abban áll, hogy egy hűmán IL-2-t kódoló bázis-szekvenciával rendelkező DNS-t hordozó transzformánst tenyésztünk és az említett fehérjét a - tápközegből elkülönítjük és tisztítjuk. A jelen találmány gyakorlatában alkalmazandó, humán IL-2-t kódoló DNS pl. egy DNS (I), amely a 2. ábrában levő 1-133 kódonok által definiált bázis szekvenciával rendelkezik. Ez a DNS (I) adott esetben viselhet 5’ végen vagy ATG-t, vagy egy olyan szig.nál-szekvenciát, amelyet a 2. ábrában az Sl-S2Q kódonok reprezentálnak; és 3’ végep előnyösen TAA-t, TGA-t, vagy TAG-t, legelőnyösebben TGA-t visel. A DNS (I)f előnyösen a promotertől lefelé kapcsolódik, a promoterre példák lehetnek a triptofán(trp)promoter, a rec A promoter, vagy A PL promoter, alkalmas módon a trp vagy a A PL promoter. A jelen találmánnyal összhangban a humán IL-2-t kódoló mRNS-t egy pl. konkanavalin A-val stimulált humán perifériás leukocita tenyészetből izoláljuk, majd reverz transzkriptázt alkalmazva egy egyszálú cDNS-t szintetizálunk, és a továbbiakban egy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
