200792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fibrinolitikus enzimek és hatóanyagként a fenti enzimeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 200792 B 4 veti aktivétort egy humán (rosszindulatú) melanoma sejtvonal választja ki, és a molekulatömege szintén 72000 dalton. Redukálószerek jelenlétében két alegységre esik szét, amelyek molekulatömege 39000 és 33000 dalton. A fenti szöveti aktivátort kísérletesen - nyulakon - és két betegen is vizsgálták, de klinikai alkalmazását erősen korlátozza az a tény, hogy az anyag rákos eredetű, mivel nyilvánvalóan nem használhatunk rosszindulatú sejtből származó anyagot terápiás célra. Az a két beteg, akin a szöveti aktivátort kipróbálták, menthetetlen állapotban volt, és a kezelés nélkül szinte bizonyosan meghalt volna. A HEPA - mind a klinikai alkalmazásban, mind az állatkísérletekben - sokkal hatásosabb és biztonságosabb véralvadéklizáló szernek bizonyult, mint az urokináz. Ennek oka az, hogy a HEPA szelektíven aktiválja a trombushoz kötött plazminogént, és nem hat a keringő plazminogénre. S. Yang és munkatársai .Fibronektin hiánya és plazminogénaktivátor jelenléte normális és rákos hámszövetsejt-tenyészetekben' c. munkájukban [J. Cell Biology 84, 120-130 (1980)] ismertették plazminogénaktivátor jelenlétét humán hámszövetsejtek tenyészetében, amelyet vagy elsődleges vagy csak néhányszor átoltott kultúrák, vagy rákosok voltak. H.S. Smith és munkatársai .Humán karcinomákból és nem-rákos szövetekből tenyésztett hámszövetsejtek tulajdonságai' c. munkájukban [J. Supramolecular Structure 11, 147-166 (1979)] szintén leírták, hogy rákos vagy primer hámszövetsejt-tenyészetekben plazminogénaktivátor termelődik. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy bizonyos epiteliális sejtekből származó sejtvonalak szövettenyészetekben plazminogénaktivátor hatású enzimeket képesek termelni. Továbbá azt is megállapítottuk, hogy az egyik sejtvonalból származó enzim saját fibrinolitikus aktivitással is rendelkezik, vagyis az enzim maga - plazminogén távollétében - is képes a fibrint lizálni. A találmány szerinti eljárással tehát előállíthatok olyan enzimek, amelyek saját fibrinolitikus aktivitással rendelkeznek, és/vagy plazminogénaktivátor hatásuk van. A fenti enzimeket úgy állítjuk elő, hogy GPK jelzésű (CNCMI-222 számon deponált) vagy BEB jelzésű (CNCMI-221 számon deponált) hámszövet sejtvonalat tenyésztünk, és a tenyészetből izoláljuk az enzimtartalmú frakciót. Az enzimtartalmú frakciót úgy választjuk el, hogy az enzimet tartalmazó felülúszókat összegyűjtjük, vagy a sejtekből extraháljuk az enzimet tartalmazó frakciót. A találmány szerinti eljárás értelmében a kiválasztott sejteket a szokásos szővettenyésztési eljárással - például szérumtartalmú táptalajon - sorozattenyészetben tenyésztjük. Ha a sejtek a megfelelő osztódási szakaszba értek, a szérumtartalmú táptalajt szérummentes táptalajra cseréljük. A sejteknek ezután fiziológiásán megfelelő körülményeket biztosítunk, amíg a kivént enzimtermelést elérjük, majd az enzimet a felülúszóból, vagy a sejtek közvetlen extraháláséval kinyerjük.A visszanyerésre bármely arra alkalmas eljárást felhasználhatunk, előnyösen úgy járunk el, hogy a felülúszó-alikvotokat egyesitjük, a szuszpendált sejteket centrifugáléssal eltávolítjuk, majd fém-kelátot képezünk, végül ioncserélő és/vagy kizárásos kromatográfiás eljárást alkalmazunk. A proteintartalmú frakciókat a 280 nm-nél mért UV-abszorpció segítségével választjuk ki, *és a proteintartalmú frakciók fibrinolitikus és/vagy plazminogénaktivátor aktivitását fibrinlemez módszerrel és/vagy fibrinalvadék lízisidö módszerrel határozzuk meg. A találmány szerinti eljárással a fenti sejttenyészetekből izolált enzimek molekulatömege 62000 ± 3000 dalton, nátrium-dodecil-szulfátos poli(akril-amid)-gélelektroforézis (SDS-PAGE) eljárással, redukáló körülmények között meghatározva. Nem redukáló körülmények között molekulatömegük - 56000 dalton, izoelektromos pontjuk 4,6. Az enzimek amino-savanalizis-eredményeit a 3. táblázatban adjuk meg. A találmány szerinti eljárással előállított enzimek véleményünk szerint újak, és gyógyászatiig elfogadható hordozó- vagy higitóanyagokkal összekeverve gyógyászati készítményekké alakíthatók. A hordozót az alkalmazás módjától függően választjuk meg. Parenterális alkalmazásra szánt készítmény esetén hordozóként steril, lázkeltő anyagoktól mentes fiziológiás sóoldatot használunk. Az enzimeket orális készítmény formájában is adhatjuk, ebben az esetben a szokásosan használt segédanyagokkal keverjük össze a hatóanyagot. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítményeket a vénás trombózisok - beleértve a mélyvénás és a retina-trombózist is - diagnosztizálására, megelőzésére és kezelésére, tüdőembóliák, szívbelseji alvadás, artériás tromboembóliák, hajszáleres tromboembóliék, gyulladásos exsudativ rendellenességek esetén, vagy olyan esetekben alkalmazzuk, amikor a testüregekben vér található, .például mellűri vérgyülem esetén. A fentebb említett egyik sejtvonalat az University College, London tenyészet-gyűjteményében tartják fenn,. GPK név alatt, míg a másik sejtvonalat ugyanott, BEB név alatt tartják fenn, és mind a két sejttenyészetet letétbe helyeztük a nemzetközileg is ismert Pasteur Intézet Mikroorganizmus-tenyészetek Nemzetközi Gyűjteményében 1983. február 25- -én, a BEB letéti száma 1-221, a GPK letéti ^száma 1-222. Az előzőekben ismertetett, humán extrinsic plazminogénaktivátorral (HEPA) összehasonlítva a találmány szerinti eljárással előállított enzimek molekulatömege és aminosav-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
