200792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fibrinolitikus enzimek és hatóanyagként a fenti enzimeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
6 5 HU 200792 B -összetétele (amely a 3. táblázatban látható) eltérő. A GPK-ból származó enzim pedig • saját fib— rinolitikus hatással is rendelkezik, azaz nemcsak a plazmin felszabadításán keresztül, ha- 5 nem közvetlenül, enzimatikusan is hat a fib— rinre, mint az a 4. ábrán is látható. Az enzimek találmány szerinti előállítását és jellemzését részletesen az alábbiakban ismertetjük. 10 A letétbe helyezett BEB és GPK sejtvonalat az alábbi eljárásokban használjuk. a) A szövettenyészetek fenntartása 15 A sejttenyészeteket folyamatosan hetente végzett átoltással tartjuk fenn. Az éppen összefolyó sejteket 10% tripszint tartalmazó dextróz-só-oldattal 2-3 percig végzett kezeléssel leválasztjuk, közel 2 ml táptalajjal 20 centrifugacsóbe visszük, és 4 percen ét 800 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A sejttömeget ezután 1 ml táptalajban újra szuszpendáljuk, 20 /ml alikvotból Coulter-számlálóban sejtszámlálást végzünk, majd 25 a sejtekkel beoltjuk a tiszta steril tenyésztőlombikban lévő táptalajt, és a lombikot CO2 inkubátorban 37 °C-on tartjuk egy héten át, igy nyerjük az alaptenyészetet. A szokásos sejtszám GPK esetén 103 sejt/ml. A szennye- 30 zódést autoradiogréfiás módszerrel ellenőrizzük (BEB esetén a 19. átoltásnál, GPK esetén a 34. és 50. átoltásnál). A sejteket lemezre visszük és 5 órán át 1,0 juCi/ml végkoncentrációjú 3H-timidinnel jelezzük. Ilford K2 gél 35 formájú emulzióval lefedjük a lemezeket, majd egy héten ót 4 °C-on tároljuk, Giemsa-festékkel megfestjük, és megvizsgáljuk a mag jelzését és az egyéb, citoplazmás vagy nem-sejtes jelzéseket. Mind a két sejtvonal- 40 nál csak a normális megjelölést észleltük. A mikoplazma-szennyezödést szintén kizártuk mind a két tenyészetnél (BEB-nél a 17., GPK-nál a 7. átoltásnál.). Az enzim előállítására a GPK-ból’ a 33-53. 45 átoltásokat, a BEB-ból a 19-27. átoltásokat használjuk fel. b) Tárolás cseppfolyós nitrogénben 50 A fentebb leírt tripszinezés és sejtszámlálás után a sejteket lecentrifugáljuk és 7,5% dimetil-szulfoxidot tartalmazó táptalajban újra szuszpendálva 2 x 10® sejt/ml sejtkoncentrációt állítunk be. 55 A sejtszuszpenziót ampullákba töltjük, az ampullákat polisztirol dobozba helyezzük, majd lépcsőzetesen az alábbiak szerint lehűtjük: 3 órán át +4 °C-on, 30 percen át -18 °C-on és egy éjszakán ót -70 °C-on 50 tartjuk, majd cseppfolyós nitrogénben tároljuk. c) A sejttenyészet regenerálása a cseppfolyós nitrogénben tárolás után A regenerálandó sejteket tartalmazó ampullákat kiemeljük a cseppfolyós nitrogénból, és 35 °C-os vizet tartalmazó főzőpohárba helyezve gyorsan felolvasztjuk. A sejteket ezután 10 ml táptalajt tartalmazó tenyésztölombikba visszük, és egy éjszakán át 37 °C-on állni hagyjuk. A kővetkező napon a táptalajt lecserélve eltávolítjuk a dimetil-szulfoxidot. d) A tenyészet méretnagyitása Az egy sejt által termelt enzim mennyisége rendkívül csekély (0,1 pg/sejt), ezért nagy méretű tenyésztőrendszerre van szükség, hogy a sejteket megfelelően nagy koncentrációban állíthassuk elő, ahelyett, hogy sok, kis méretű tenyésztő berendezéssel dolgoznánk. Az is fontos, hogy a tenyésztőrendszerben olyan koncentrált terméket nyerjünk, amilyen egyáltalán lehetséges, hogy a tisztítási műveletet megkönnyítsük. A következő tenyésztőrendszereket alkalmazva nagyítottuk a sejt- és enzimtermelést 25 és 75 cm^es lombikméretról: i) Forgópalackos tenyészet Különböző méretű polisztirol- és üvegpalackok lassan (12 fordulat/óra sebességgel) forognak a szövettenyésitésre szokásosan használt berendezésben. A hozam növekedése annak tulajdonítható, hogy egyetlen felület helyett az edény egész belső felülete hasznosítható. A fenti módszerrel az enzim koncentrációja is megnövekszik, mivel- a sejtek és a táptalaj aránya megnövekedik, a nyugvó tenyészethez viszonyítva. ii) Tárcsás keverés tenyészet A tenyészet felületét sok lapos, kőralakú, rozsdamentes acéltárcsa képezi, amelyek vízszintesen, egymástól 2-4 mm távolságra egy keverő tengelyére vannak szerelve. Az igy felszerelt tengelyt fermentoredénybe helyezzük, és lassan - legfeljebb 100 fordulat/perc sebességgel - forgatjuk. A tenyészet mérete 5 liter és 210 1 között változhat, ami 12200 - 330000 cm2 tenyésztőfelületnek felel meg. Noha a sejttömeg nagyobb mértékben növelhető, nem keletkezik koncentráltabb termék. iii) Mikrohordozós tenyészet A mikrohordozók kis méretű gömbök, amelyek felületén a sejtek szaporodni tudónak, és amelyeket állandó keveréssel szuszpenzióban tartunk. A fenti módszer lehetővé teszi, hogy olyan nagy léptékű fermentációs berendezést is használhassunk a szubsztráthoz tapadt sejtek tenyésztésére, amelyet 5
