200752. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására biotechnológiai úton
I HU 200752 B o hígítót! szubsztrát-oldattal, vagyis megfelelő enzimstabilitást biztosító körülmények között dolgozhatunk, feldolgozási és szennyvíztisztítási nehézségek jelentkezése nélkül. Az enzimatíkus hidroxilezést nikotinsav-hidroxiláz forrásként alkalmazott mikroorganizmus segítségével végezzük. Azt tapasztaltuk, hogy a 6-hidroxi-nikotinsav jó eredménnyel állítható elő a Pseudomonas, Bacillus és Achromobacter nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok segítségével. Előnyösen alkalmazhatók a Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 (tipikus törzs), Pseudomonas putida KB1 NCIB 10521, NCIB 8176, vagy egy bacillus törzs, amelyet Ensign és Rittenberg [J. Bioi. Chem. 239, 2285-2291 (1964)] ismertetett. Különösen előnyösen alkalmazható az új Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 törzs, amely nikotinsav-anyalúgból izolálható. Morfológia és fiziológia Tenyésztés: táptalajon (1) A sejt alakja: 2-3,5 pm hosszú és mintegy 0,6 jam széles pálcikák (2) Elrendeződés: egyesével (3) Motilitás: erősen mozgékony (körkörösen ostoros) (4) Endospórák: kizárólag aerob (5) Gram: negatív (6) Oxidáz: pozitív (7) Kataláz: pozitív. A törzs minden jellemzőjében azonos az Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 tipikus törzzsel. (Kivétel: az acetamid hidrolízise.) A fenti törzseket a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM): (Mikroorganizmusok Németországi Gyűjteménye) Intézetnél (Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen, NSZK) a DSM 2402 és DSM 2783 szám alatt vannak deponálva. Az új DSM 2783 számú törzs deponálásának napja: 1983. 11. 18. A Pseudomonas putida NCIB 10521 és 8176 számú törzsek a National Collection of Industrial Bacteria Intézetnél (Tony Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB98DC, Skócia) találhatók meg. A fenti törzsek egyedüli szén-, nitrogén- és energiaforrásként nikotinsavon fejlődnek. A mikroorganizmusok tenyésztését az ilyen típusú törzseknél szokásos eljárással végezzük. Például a DSM 2783 törzs hígított és sterilizált nikotinsav-oldatban (0,05-0,5 tömeg%) fermentálható, amely pH=7,0 foszfát-puffért, - 50 mmól - valamint nyomelemeket (20 mg/1 CaCl2-2H20, 10 mg/1 MnSCU, 5 mg/1 FeSOa x 7H20, 0,1 mg/1 C0CI2 x 6H2O, 0,1 mg/1 CuS04 x 5H2O, 0,1 mg/1 Z11SO4 x 7H2O, 0,1 mg/1 NaMoC>4 x 2H2O), továbbá a fejlődés gyorsítása érdekében kis mennyiségű élesztőkivonatot (Merck) (0,05 tömeg%) tartalmaz. A fermentációt 24—48 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten aerob körülmények között végezzük. A kapott biomassza (mintegy 10 g nedves tömeg literenként) nikotinsav-hidroxilázban gazdag. A sejteket lecentrifugáljuk, és azonnal vagy -20 'C hőmérsékleten történő tárolás után közvetlenül, vagyis ezimkinyerés vagy tisztítás nélkül felhasználható a nikotinsav hidroxilezéséhez. A nikotinsav hidroxilezése érdekében célszerű, ha a nikotinsav leépítését nem az első lépéssel, vagy nem a 6-hidroxi-nikotinsavvá történő hidroxilezéssel indítjuk. Ebben a fázisban a mikroorganizmus fejlődése a kitermelés rovására növekszik. Mint említettük, a DSM 2783 törzs hígított nikotinsav oldatban (0,05-0,5 tömeg%) jól fejlődik, és a nikotinsavat teljes mennyiségben felhasználja. A nikotinsav növekvő koncentrációja azonban gátolja a sejt növekedését és 2 tömeg% nikotinsav koncentráció felett további fejlődés nem figyelhető meg. A nikotinsav-hidroxiláz aktivitása a sejten belül változatlan marad. A katabolikus leépítés a hidroxilező lépés után megszakad. Ez kiküszöböli a mellékreakciókat és növeli a 6-hidroxi-nikotinsav tisztaságát és kitermelését. A következő példák közelebbről mutatják be a találmány gyakorlati alkalmazását. 1. példa Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 sejtek előállítása 51,9 g NaaHPCU x 2H2O 20,0 g KH2PO4, 2,5 g élesztőkivonat és 10 g nikotinsav keverékéből, valamint 4750 ml vízből álló tápoldatot töltünk a fermentorba, és 20 percen keresztül 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Ezután 30 'C hőmérsékletre hűtjük és 500 ml indítókultúrával beoltjuk. A fermentálást 30 °C hőmérsékleten pH=7,0 érték mellett levegőztetés közben 24 órán keresztül végezzük. Ezután 200 ml steril oldatot adunk hozzá, amely vízben oldva 10 g nikotinsavat és 2,5 g élesztőkivonatot tartalmaz. A fermentációt 42 órán keresztül folytatjuk. Ezután a kultúrát begyújtjuk és az Achromobacter sejteket centrifugálással (30 perc 15 000 g mellett) elválasztjuk. Ily módon 38,3 g nedves biomasszát kapunk. Egy 7 literes fermentorban szilárd magnéziumoxid adagolásával előzetesen pH=7,l értékre állított 2750 ml 2 %-os nikotinsav oldatot 30 “C hőmérsékletre melegítünk. A hidroxilezés 200 ml koncentrált Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 szuszpenzió (végkoncentráció: 1010 sejt/ml) hozzáadásával indul. Habzásgátló szer [például poli(propilén-glikol) P- 2000] hozzáadás után az elegyet intenzív kevertetés közben levegőztetjük. A fermentort 30 'C hőmérsékleten termosztáljuk. A pH értékét pH- mérő és nikotinsav-oldat adagoló (teljes felhasználás 23 g) segítségével pH=7,0 értéken tartjuk. A szubsztrátkoncentrátumot vezetőképességmérő segítségével folyamatosan méijük. Ezt a szabályozón keresztül egy perisztaltikus pumpa segítségével kapcsoljuk a rendszerhez. Ha a szubsztrátkoncentráció a magnézium-hidroxi-nikotinát képződése és kiválása miatt csökken, egy előtétedényből 1 mólos magnézium-nikotinát oldatot pumpálunk a rendszerhez, míg az eredeti vezetőképességet ismét elérjük. így a szubsztrátkoncentrátum automatikusan szabályozható. A magnézium-hidroxi-nikotinát kristályai a fermentor edény alján gyűlnek össze, onnan szakaszosan eltávolítjuk, leszűrjük és a szűrletet a fermentorba visszavezetjük. A rendszert 3 napon keresztül folyamatosan üzemeltetjük, miközben 3 liter 1 mólos magnézium-nikotinát oldatot adagolunk hozzá. Az adagolás befe5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
