200752. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására biotechnológiai úton
1 HU 200752 B 2 jeződése után a reaktort még 5 órán keresztül üzemeltetjük, majd kiürítjük. A szuszpenziót leszűrjük, amelynek során 5,3 liter szűrletet és 650 g nedves magnézium- vagy bárium- hidroxi-nikotinátot kapunk. A magnézium-hidroxi-nikotinát teljes mennyiségét 2,5 liter vízben szuszpendáljuk és koncentrált sósavval pH=l,2 értékig savanyítjuk. A kiváló 6-hidroxi-nikotinsavat leszűrjük. A még nedves kristályokat 400 ml vízzel mossuk, majd szántjuk. Ily módon 468,8 g fehér mikrokristályos terméket kapunk, amely HPLC-analízis alapján 98,8 % 6-hidroxi-nikotinsavat tartalmaz. A felhasznált nikotinsav mennyiségére vonatkoztatott kitermelés értéke 91,6 %. Olvadáspont: 139 °C. 2. példa 2,5 liter térfogatú fermentorba 1 liter 3 tömeg%-os vizes níkotinsav szuszpenziót töltünk és szilárd báriumoxid adagolásával pH=7,0 értékre állítjuk. Ezt a szubsztrát oldatot 30 °C hőmérsékleten termosztáljuk. Habzásgátló szer (Rhodorsil 70414) hozzáadása után 70 ml koncentrált Achromobacter xylosoxydans DSM 2789 szuszpenziót (OD550=90) adunk hozzá. A szuszpenziót intenzíven levegőztetjük és kevertetjük. A pH értékét szilárd nikotinsav adagolásával folyamatosan 7,0 értéken tartjuk. A szubsztrátum (1 mólos bárium-nikotinát oldat) adagolását az 1. példában ismertetett módon vezetőképesség mérő és szabályozó rendszer segítségével automatizáljuk. 2-3 óra után a bárium-hidroxi-nikotinát koncentrációja eléri a telítettségi értéket, és a termék kristályosodni kezd. A kristályok a fermentor alján gyűlnek össze, ahonnan szakaszosan el távolíthatók. A kristályokat leszűrjük és a szűrletet visszavezetjük. A rendszert 60 órán keresztül folyamatosan üzemeltetjük. A hidroxilezés alatt I liter 1 mólos nikotinsavat (báriumsó formájában) adagolunk a fermentorba. A pH ellenőrzéséhez további 6,8 g szilárd nikotinsavat használunk el. Ezután a fermentort kiürítjük és a falra tapadt bárium-hidroxi-nikotinát kristályokat eltávolítjuk. A szuszpenziót leszűrjük. Ily módon 1,9 liter szűrletet kapunk, amely HPLC-analízis alapján 0,5 tömeg% nikotinsavat és 2,4 tömeg% 6-hidroxi-nikotinsavat tartalmaz. A nedves bárium-hidroxi-nikotinát teljes mennyiségét 200 ml vízben szuszpendáljuk, koncentrált sósavval pH=l,2 értékre állítjuk. 2 órás kevertetés után a 6-hidroxi-nikotinsavat leszűrjük, 100 ml vízzel mossuk és vákuumban 50 °C hőmérsékleten szárítjuk. Ily módon 118,9 g enyhén sárgás 6-hidroxi-nikotinsavat kapunk, amely HPLC-analízis alapján 98,3 %os. Ez a felhasznált nikotinsav mennyiségére vonatkoztatva 64.7 %-os kitermelésnek felel meg. Olvadáspont: 139 °C. Ha a szűrletben visszamarad bárium-hidroxi-nikotinsav analítikailag kimutatott mennyiségét is hozzászámítjuk, az ossz kitermelés értéke 89,9 %. 3. példa 1. Pseudomonas putida NC1B 8176 biomassza előállítása 52 g NazHPOa x 2H:0, 20 g KH2PO4, 2,5 g élesztőkivonat és 10,0 g nikotinsav keverékéből és 4750 ml vízből álló tápoldatot egy 7 literes Chemap-fermentorban sterilizálunk 20 percen keresztül 120 °C hőmérsékleten. Ezután 30 °C hőmérsékletre hűtjük, majd 50 ml steril nyomelemoldatot adunk hozzá, oly módon, hogy az alábbi végkoncentrációkat érjük el: CaCh x 2H20 20 mg/1, MnS04 10 mg/1, FeSOa x 7H20 5 mg/1, C0CI2 x 6H2O 0,1 mg/1, CuS04 x 5H2O 0,1 mg/1, ZnS04 x 7H20 0,1 mg/1, NaMoC>4 x 2H2O 0,1 mg/1. A fermentort 500 ml Pseudomonas indítókultúrával oltjuk be és 30 °C hőmérsékleten pH=7,0 érték mellett levegőztetés közben 24 órán keresztül fermentáljuk. 24 óra elteltével 200 ml steril oldatot adunk hozzá, amely 10 g nikotinsavból és 2,5 g élesztőkivonatból áll. 38 óra elteltével a sejttömeget centrifugálással (30 perc 10 000 g mellett) elválasztjuk. Ily módon 43,3 g nedves biomasszát kapunk. 2. A nikotinsav hidroxilezése 3,5 literes fermentort 2 liter 0,5 tömeg%-os nikotinsavoldattal töltjük meg, amelyet szilárd magnéziumoxiddal pH=7,0 értékre állítunk, majd 30 °C hőmérsékletre melegítünk. A hidroxileződés 20 g nedves Pseudomonas putida NCEB 8176 biomassza hozzáadásával indul be, amely biomasszát előzőleg 100 ml vízben felvettük. Habzásgátlószer [poli(propilén-glikol) P-200, Fluka] hozzáadása után a rendszert olyan sebességgel levegőztetjük, hogy az oldott oxigén koncentrációja 3-5 mg/1 értéken maradjon. A rendszert nikotinsav adagolásával (teljes felhasználás 15,2 g) pH=7,0 értéken tartjuk. A szubsztrátkoncentrátumot 1 mólos magnézium-nikotinát oldat vezetőképesség alapján történő szabályozott adagolásával konstans értéken tartjuk (lásd az 1. példát). A telítési koncentráció elérése után a 6-hidroxi-nikotinsav magnéziumsója kiválik. A fermentor alján összegyűlő kristályokat szakaszosan eltávolítjuk, majd szűrjük. A keletkező szűrletet új 1 mólos magnézium-nikotinát oldat előállításához használjuk fel. A kristályokat nedvesen tároljuk. A kiindulási anyag (1 mólos magnézium-nikotinát oldat) adagolását mérjük, és a fermentor teljes enzimaktivitásának meghatározásához használjuk fel. Az aktivitás csökkenését nedves, friss biomassza hozzáadásával kompenzáljuk (naponta egyszer). A fermentálást 5 napon keresztül végezzük. Ez idő alatt 1,6 liter 1 mólos magnézium-nikotinát oldatot vezetünk a fermentorba. A kitermelés meghatározásához a fermentort kiürítjük és a falra tapadt kristályokat eltávolítjuk. A kristályokat leszűrjük. A nyert magnézium-hidroxi-nikotinát teljes mennyiségét 1,5 liter vízben szuszpendáljuk és koncentrált sósavval lassan pH=l,5 értékre állítjuk. A 6- -hidroxi-nikotinsav kristályait leszűrjük, a szűrőn 200 ml vízzel mossuk és vákuumban 60 'C hőmérsékleten szárítjuk. Ily módon 365,0 g fehér kristályt nyerünk, amely HPLC-analízis alapján 99,3 %-os. A fermentorba bevezetett nikotinsav mennyiségére számolva ez 92,4 %-os kitermelésnek felel meg. Olvadáspont: 139 ”C. 4. példa A Bacillus sejtek előállításához Ensign és Rittenberg módszerét (J. Bioi. Chem. 239, 2285—2291, 1964) alkalmazzuk. Ennek során egy tápoltlatot. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
