200695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó stabil gyógyszerkészítmények elöállítására
HU 200695 B nálison egy Gly-Ala-Aig többlet-szekvencia is tartalmazhat a peptid. Az 1. ábra szerinti polipeptidben 35 cisztein-maradék van, Így 17 diszulfid-híd kialakítására van lehetőség. Más, részletesen felderített szerkezetű proteinek analógiájára alapozva a diszulfid-kötés kialakulásából kiindulva a 90-es helyzetű aminosav és a C-terminális prolin közötti szekvencia feltételezett szerkezete a 2. ábra szerinti. Az N-terminális rész szerkezete kevbésbé világos, noha már arról is ismertettek néhány elképzelést [Progress in Fibrinolysis, 6, 269-273 (1983); és Proc. Natl. Acad. Sei, 81.5355- 5359 (1984)]. A t-PA szerkezetének legfontosabb jellemzőé az a két „kringle régió (a 92. és a 173. aminosav, és a 180. és 261. aminosavak között), amely a protein fibrinhez kötődéséért felelős, és a szerin-proteáz régió, amely a B-lánc legnagyobb részét magában foglalja, és amely aplazminogén aktiválásért felelős. A szerin-proteázokban különleges fontosságú aminosavak a His/Asp/Ser íratalíHlms triári, amelyek a t-PA-ban a 322., 371. és 463. helyzetben fordulnak elő. A 264. és 395. cisztein aminosav-maradékok közötti diszulfid-híd is fontos, mert ez tartja össze a t- PA A- és B-láncát, a t-PA kétláncú formájában. Az 1. és 2. ábrán az aminosav-maradékok jelölésére a szokásos egy, illetve hárombetűs kódokat használjuk, az alábbiak szerint: 3 Asp D azsparaginsav Cys C cisztein Thr T treonin Val V valin Ser S szerin Met M metionin Ghi E glutamin Be I izoleucin Pro P prolin Tyr Y tirozin Gly G glicin Phe F fenilalanin Alá A alanin His H hisztidin Lys K lizin Trp W triptofán Leu L leijein Gin Q glutamin Arg R argnin-Asn N aszparagin A t-PA-t az ismert eljárások bármelyikével előállíthatjuk. például kinyerhetjük normál vagy rákos sejttenyészetekből [Biochim et Biophys. Acta 580. 140-153 (1979); A-41.766., vagy A-113319. számú európai szabadalmi leírások], A t-PA-t előnyösen rekombináns DNS-technika alkalmazásával nyert transzformált vagy transzfektált sejtvonal tenyészetéből állítjuk elő, például az A-93.619., A-117.059. vagy A-l17.060. számú európai szabadalmi leírásokban ismertetett módon. Különösen előnyös, ha a t-PA termelésére kínai hörcsög ovárium (CHO) sejteket használunk, amelyet a [Molecular and Cellular Biology 5(7), 1750-kl759 (1985)] szerint állítunk elő. Ekkor a klónozott gént a dihidrofolát-reduklázt kódoló génnel (dhfr) kontranszfektálva visszük a dhfr' CHO sejtekbe. A dhfr-t expresszáló transzformált sejteket nukleozidoktól mentes táptalajon szelektáljuk, és növekvő koncentrációjú metotréxáttal kezeljük. A dhfr és t-PA gének így egyesülnek és olyan stabil sejtvonalat eredményeznek, amelynek t-PA termelő képessége igen magas. A t-PA-t előnyösen ismert módon tisztítjuk [például Biochim. et Biophys. Acta 580.140-153 (1979); J. Bioi. Chem. 254(6), 1998-2003 (1979); J. Bioi. Chetn. 256(13), 7035-7041 (1981); Eur. J. Biochem. 132 681-686 (1983); A-41.766., A-113.319. számú európai vagy A-2.122219. számú nagy-britanniai szabadalmi leírások]. Úgy tűnik, hogy a t-PAoldékonyságának nincs felső határa a parenterális oldatban. Igen nagy koncentrációkban —150.000.000NE/ml-nél magasabb koncentrációban—az oldat csak viszkózussá válik, anélkül, hogy a t-PA jelentős mértékben kicsapódna. A t- PA koncentrációját a parenterális oldatban így széles határok között változtathatjuk, példád az 50.000-50.000. 000 NE/nd lehet A találmány szerinti eljárás előnyének maximális kihasználására a t-PA koncentrációját 100.000 NE/ml-nél nagyobbra, közelebbről 500.000 NE/ml-nél nagyobbra, legelőnyösebben 1.000. 000 NE/mnl-nél nagyobbra választjuk. A legelőnyösebb, ha a t-PA koncentrációja közel 5.000.000 NE/nd. A parenterális oldat pH-értékének felső határa előnyösen 4,5. Az oldat pH-ja előnyösen 2,5-4,0, még előnyösebben 2,8-3,5, legelőnyösebből 3,0. A parenterális oldat kívánt pH-értékét célszerűen fiziológiailag elfogadható szervetlen vagy szerves savakkal — például hidrogén-kloriddal, kénsavval, salétromsavval; illetve citromsavval, borkősavval vagy benzolszulfonsawal — állítjuk be. A fenti savak közül előnyösen hidrogén-kloridot használunk. Noha az oldatban bizonyos fiziológiailag elfogadható társ-oldószerek is jelen lehetnek, a parenterális oldat közege előnyösen teljes egészében vagy lényegében víz. A parenterális oldat a beteg vérszérumával hipertóniás, hipotoniás vagy izotoniás lehet. Anemldvánatos mellékhatások elkerülésére az oldat előnyösen izotoniás, noha kis eltéréseknek nincs nagy fiziológiás jelentőségük. Lényegében izotoniás parenterális oldatot egy olyan fiziológiailag elfogadható anyag bevitelével állíthatunk elő, amely képes az oldat tonicitását a kívánt szintre növelni. A fenti anyag ismert módon például dextróz (vízmentes vagy monohidrát formában), nátrium-klorid, vagy ezek elegye lehet Az anyag koncentrációja a parenterális oldatban természetesen az alkalmazott anyag minőségétől függően változik. Nátrium-klorid esetén a koncentráció előnyösen 7-10 mg/ml, legelőnyösebben 8,5 mgfl, ez utóbbi koncentrációt gyakran a fiziológiás sóoldal koncentrációjának is nevezik. Vízmentes dextróz esetái a koncentráció előnyösen 30-70 mg/ml, legelőnyösebben 50 mg/ml Abban az esetből, ha a t-PA koncentrációját a lényegében izotoniás parenterális oldatban csökkenteni kell, a hígítást ugyanazon anyag ugyanazon koncentrációjú viz» oldatával végezzük előnyösen, így az oldat izotóniás marad. A parenterális oldata fenti típusú gyógyszerkészítményekben szokásosan alkalmazott adalékanyagokat is tartalmazhat, példaként a humán szérumalbumint említhetjük. Ezenkívül, mivel a t-PA hajlamos flveg- és műanyagfelületekhez adszorbeálódni, az adszorpció csökkentésére vagy elkerülésére a parenterális oldat célszerűen felületaktív szót is tartalmazhat Felületaktív szóként például a szorbit-anhidrid részleges zsírsav-észtereinek poli(oxi-etilén)-származékait használhatjuk, például a Tween 80 néven kereskedelmi forgalomban lévő anyagot A t-PA lényegesen megnövekedett oldékonyságán kívül a találmány meglepő előnye, hogy a fent megadott pH-értékek közé eső, savas parenterális oldat hasznáata nem okoz semmiféle káros fiziológiai hatást a betegből. Úgy tűnik, hogy a véráram általában 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
