200695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó stabil gyógyszerkészítmények elöállítására
HU 200695 B A találmány tárgya eljárás szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó nagy töménységű, stabil, parenterális gyógyászati készítmények előállítására, amelyek a humán- és állatgyógyászat területén alkalmazhatók. A véralvadék kialakítására képes enzimrendszer - -azaz a koagulációs rendszer—és az ép, szabad vérpályát biztosító, véralvadékot oldó enzimrendszer— azaz a fibrinolitikus rendszer között feltehetően dinamikus egyensúly áll fenn. A sérüléseknél a vérveszteség megakadályozására a sérült véredényekben véralvadék képződik. A sérülés természetes gyógyulása után a felesleges véralvadék a fibrinolitikus enzimrendszer működése következtében feloldódik. Előfordulhat azonban, hogy külső sérülés nélkül is keletkezik véralvadék, amely a fő véredényekbe kerülhet, és ezáltal részben vagy teljesen elzáriiatja a véráramlást Ha ez a szívben, tüdőben vagy ágyban következik be, szív-infarktus, tüdő-embólia vagy gutaütés lehet a következménye. A fenti okok együttesen a legfőbb betegséget és halált okozó tényezők az iparilag fejlett országokban. A vénögök fibrin-hálóból állnak, amelyet a plazmin nevű proteolitikus enzim képes oldani. Az enzim az inaktív proenzimből, a vérplazma egyik komponensét alkotó plazminogénből keletkezik, egy plazminogén-aktivátor hatására. Két, immunokSgiailag megkülönböztethető emlős plazminogén-aktivátor van. A belső (inherens) plazminogén aktivátor — amely urokináz néven is ismert—a vesében termelődik és a vizeletből izolálható. A külső (exogén) plazminogén aktivátor, más néven vaszkuláris plazminogén aktivátor vagy szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) számos szövet-homogenizátumból — például emberi méhszövetből — ér-sejtfalból és bizonyos sejttenyészetekből izolálható. A fenti kétfajta plazminogén aktivátoron kívül egy bakteriális eredetű tennék, a streptokináz is létezik, amelyet ß-bemolizáló streptococcusokból izoláltak. A fenti két urokináz és a streptokináz közös nagy hátránya, hogy az egész keringésből, és nemcsak a véirög kialakulásának helyén fejtik ki hatásukat így például más vérproteineket - fibrinogént, protrombint, V. faktort és VIII. faktort is tönkretehetnek, ezáltal csökken a vér alvadási képessége és nő a vérzékenység veszélye. Ezzel szemből a t-PA biológiai aktivitása a fibrin jelenlététől függ, amelyhez kötődik, és ott aktiválódik. A maximális aktivitás így csak a véralvadás helyén, azaz a feloldandó fibrinháló jelenlétében jön létre, és így a vérzékenység veszélye nem áll fenn. A t-PA-t főleg intravaszkuláris infúzió formájában alkalmazzák, így a t-PA-t parenterális oldattá kell formálni. Általában kívánatos, hogy a parenterális oldatok a hatóanyagot nagy koncentrációban tartalmazzák. Ennek oka az, hogy az ilyen oldatból bármely adott helyzetben további oldószer vagy közeg hozzáadásával egyszerű hígítással elkészítheti az orvos vagy az állatorvos a kívánt koncentrációjú oldatot Másrészről nem tanácsos szív- vagy vese-betegségben szenvedő betegnek nagy oldat-térfogatokat adagolni, mivel ezzel a szivet vagy vesét még nagyobb igénybevételnek tennénk ki. Ezért a koncéntreáltabb okiatok alkalmazásával az infúziós oldat térfogatát a lehető legkisebbre kell csökkenteni. Ugyanakkor a parenterális oldatnak stabilnak is kell lennie, vagyis 1 a hatóanyagnak nem szabad kicsapódni az oldatból sem raktározás közben, se a higítási művelet során. A t-PA-t hatóanyagként tartalmazó parenterális oldatok általában az A-41.766., A-93.619., A-112.122., A-113.319., A-123.304. számú európai szabadalmi leírások, továbbá az 65-6936 és 56- 163145. számú, 57-120523., illetve 58-65218. számon közrebocsátott japán szabadalmi leírások ismertetik. A fenti készítmények a t-PA vizes sóoldattal készült oldatai, amelyek pH-ja közel semleges, és hátrányuk, hogy a t-PA oldhatósága ilyen körülmények között alacsony, ion-erősséget növelő anyagok távollétében. Ennek következtében a fenti ismert készítmények vagy alacsony koncentrációban tartalmazzák a t-PA-t, ezért bizonyos esetekben nagy térfogatban kell azokat adagolni a betegnek, vagy hipertóniások, ami a vörös-vértestekre káros lebet az alkalmazáskor. Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy a t-PA oldhatósága vizes parenterális oldatban növelhető, ha az oldat pH-ja a savas tartományba esik, és hogy glkalmflzágirnr az oldat savassága nem okoz jelentős fiziológiai problémákat. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárással előállított vizes parenterális t-PA-oldat pH-ja 2 és 5 közötti pH-tartományban van. A találmány szerinti eljárással előállított parenterális oldatban a t-PA fokozott oldékonysága következtében a t-PA nagy koncentrációban van jelen, annak veszélye nélkül, bogy a t-PA az oldatból kicsapódna. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, a t-PA-t nagy koncentrációban tartalmazó oldatot semleges vagy savas pH-jú vízzel is Hígíthatjuk, ha a t-PA koncentrációját csökkenteni kívánjuk anélkül, hogy azzel a t-PA kicsapódását idéznénk elő. A találmány szerinti eljárással előállított parenterális oldat tehát stabil, amely az orvosok vagy állatorvosok számára könnyebben kezelhető, mint az ismert készítmények. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítményben a t-PA bármely, lényegében emlős, különösen humán t-PA-nak megfelelő biológiailag aktív protein lehet, akár glükozilált, akár glükozilálatlan formában. Lehet egy- vagy kétláncú t-PA, vagy ezek elegye, amint azt az A-l 12.122. számú európai szabadalmi leírásban ismertették, és teljesen glükozilált humán t-PA esetén látszólagos móllőmege poli(akril-amid) gélen 70.000, és izoelektromos pontja 7,5-8,0. A t-PA specifikus aktivitása közel előnyös 500.000NE/mg [NE, azaz nemzetközi egység, amelyet a WHO National Institute for Biological Standards and Control (Holly Hill, Hampstead, London, NW3 6RB, Nagy-Britannia) definiált]. A t-PA aminosav-szekvenciája lényegében az 1. ábra szerinti szekvenciának felel meg, azaz vagy az 1. ábra szerinti, vagy egy vagy több allél-eredetű vagy egyéb aminosav-kiesést, -szubsztitúciót, -beillesztést, -inverziót vagy -addíciót tartalmaz oly módon, hogy a kapott szekvencia legalább 80%-ban, előnyösmi 90%-ban homológ az 1. fixa szerinti szekvenciával, és lényegében megtartja a protein biológiai és immunológiai tulajdonságait Közelebbről, a t-PA szekvenciája azonos az 1. ábrán látható szekvenciával, vagy attól annyiban tér el, hogy az N-terminális szerintól a 245. aminosav metionin helyett valin, mimellett adott esetből a szekvenciából az első három aminosav bármelyike hiányozhat, vagy az N-termi-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
