200694. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás krioprecipítátum gyártására kis plazmapoolból
HU 200694B A találmány tárgya javított eljárás krioprecipitátum gyártására kis plazmapoolból. A krioprecipitátumot elsősorban az A-tfpusú haemophilia (vérzékenység) kezelésére alkalmazzák, de felhasználják a von Willebrand betegség, kóros alvadási faktor-hiány okozta kórképek kezelésére is. A véralvadási reakciósorban a VIII alvadási faktor (glikoproteid) szintjének a normálishoz képest 1 %-ra csökkent értéke súlyos haemophiliát okoz gyakori súlyos, ismétlődően fellépő spontán vérzésekkel. A mérsékelten súlyos formánál (1-5% közötti VIII alvadási faktor szint) ismétlődő spontán ízületi vérzések lépnek fel és enyhe trauma is súlyos vérzéseket okozhat A betegség kezelésére általában az egészséges véradók vérplazmájából az ún. krioprecipitátum formájában kinyerhető VIII alvadási faktort használják közvetlenül, vagy ebből valamilyen fokban tisztított alvadási faktor készítményt állítanak elő. A krioprecipitátum azt a vérplazma frakciót jelenti, amely a megfagyasztott, majd 0-+4 *C közötti hőmérsékletre felolvasztott vérplazmában csapadék formájában visszamarad. Ez a hideg plazmában nem visszaoldódó fehérjefrakció tartlamazza a vérplazma fibrinogén tartalmának zömét, a VIII alvadási faktor jelentős részét és más vérplazma fehérjéket is. A krioprecipitátum centrifugálással elválasztható a felülúszó plazmától, a felülúszó plazma eltávolítása után a krioprecipitátum csapadék kevés felülűszó plazmában vagy megfelelő pufferoldatban feloldható. A felhasználás a termék intravénás beadásával történik. A krioprecipitátum frissen fagyasztott vérplazmából viszonylag könnyen előállítható. A szokásos korszerű műanyagzsákos vér-feldolgozási rendszerben a műanyagzsákban levő egyedi (egy véradótól származó) 200-250 ml friss plazmát legalább -20 ‘C-on megfagyasztják. Ezután +4 'C-os levegőn vagy +4 *C-os vizes olvasztó berendezésben felolvasztják és a műanyagzsákban elvő anyagot 0 *C-ra hűtött centrifugában centrifugálják. A zsák fenekére leülepedett csapadékról a felülúszó plazmát plazmaprés segítségével lenyomják és a csapadékot nátrium-kloridot és nátrium-citrátot tartalmazó pufferoldatban feloldják. A szokásos terápiás egység 5-6 egyedi vérplazma egyedi krioprecipitátumának összemosásával készül lcb. 100 ml végtéifogatban 200-400 E VIII faktor tartalommal. A termék felhasználásig fogyasztott állapotban (-20 ‘C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten) vagy liofilizálva tárolható. A krioprecipitátum alkalmazásának hátrányaként jelentkezhetnek, különösen a gyakori kezelésre szoruló betegeknél, a készítményben maradó plazmafehéiják jelenlétére visszavezethető allergiás fehérje reakciók, láz, urticária stb. Mivel a haemophiliás betegek egész életük során kezelésre szorulnak, ezért náluk az allergiás reakciók bekövetkezése szinte törvényszerű. Világszerte erőfeszítések folynak ezért tisztított VIII faktor tartalmú készítmények gyártására. A tisztítási eljárások célja a VIII faktor mellől az egyéb fehéijék eltávolítása, de ezek az eljárások, a dolog természetéből adódóan, általában nagy-plazmapoollal dolgoznak nyitott rendszerben, emiatt a végterméket sterilre kell szűrni. További nagy gondot jelentenek a vérkészítményekkel átvihető vírusbetegségek. A vérrel átvihető vírusbe1 tegségek fellépésének leküzdésénél Egyetembe kell venni azt is, hogy a vírusátvitel valószínűsége a kispoolos készítményeknél aránylag kicsi, míg a nagypoolos készítményeknék fokozott Gyakorlati szempontból tehát minden olyan megoldás előnyös, amely kis-pool szinten maradva valamilyen mértékben tisztított VDI faktor készítményt eredményez. A VIII alvadási faktor készítmények előállításának jelenleg két szintje különböztethető meg. A vérellátók egyedi krioprecipitátumot ill. egyedi krioprecipitátumok összemosásával kis-poolos krioprecipitátumot állítanak elő, cél a VHI faktor kinyerésének fokozása, a kiszerelés módjának korszerűsítése. 1986- ban Margolis, J. és Eisen, M. közölt olyan módszert (Vox Sanguinis SO, 38-41,1986), amely lehetővé teszi egyedi krioprecipitátum liofilizálását az eredeti műanyagzsákban, a krioprecipitátum tisztaságát vagy a vm foktor kinyerését azonban nem javítja az eljárás. Az üzemi méretű VEI foktor előállítás, tisztítás nyersanyaga szintén krioprecipitátum, de nagy-poolos eljárásról van szó. Ilyen módszert írt le Broadniewicz-Proba, T. és Beauregard, D. (Vox Sanguinis52, 10-14, 1987). A nyitott rendszerben végrehajtott többlépcsős tisztítási eljárás a fibrinogéntől és egyéb kísérő plazmafehérjéktől tisztítja meg a VIII faktort, bizonyos mértékű hatóanyag veszteség mellett jelentősen javítja a végtermék specifikus aktivitását. Ez egy frakcionálási eljárás, amely azonban külön üzemrészt igényel. A találmány célja olyan egyszerű eljárás kidolgozása, amellyel egy kezelési dózisnak megfelelő, magas specifikus aktivitású, csökkent idegen fehérje tartalmú krioprecipitátum állítható elő. A találmány alapja az a felismerés, hogy ha eleve egyesítjük feldolgozás előtt 3-6 egyedi vér friss plazmáját egyetlen nagyméretű (800-2000 ml névleges űrtartalmú) műanyagzsákban és ezt a kis plazmapoolt a találmányban leírtak szerint fagyasztjuk, felolvasztjuk és centrifugáljuk, a felülúszó tökéletesebb eltávolíthatósága következtében csökken a végtermék idegen fehérje tartalma és kb. kétszeresére nő a kapott krioprecipitátum specifikus aktivitása. A szakirodalomból ismert, hogy a VIII faktor kinyerésében és a krioprecipitátum fajlagos aktivitásában több tényezőnek (így pl. a fogyasztás és felolvasztás időtartama és hőmérséklete, a feldolgozás ideje stb.) lényeges szerepe van. Mivel a nagyobb méretű (1000-2000 ml-es) műanyagzsákban történő feldolgozás során a plazma fagyási és felolvasztási ideje lényegesen megnő és az optimális olvasztási hőmérséklet is nehezebben tartható fenn, az lenne várható, hogy a kapott krioprecipitátum specifikus aktivitása, valamint a VIII faktor mennyisége csökken az egyedi vérplazmák feldolgozása során kapott krioprecipitátumhoz képest. Ezzel szemben azt találtuk, hogy ha nagyméretű zsákban a feldolgozást a találmány szerinti eljárásban megadott módon végezzük, a krioprecipitátum tulajdonságait tekintve igen kedvező eredményt kapunk. Ráadásul, a poolozás a várthoz képest kevésbé növeli meg a vírusfcrtőzöüség miatt selejtezendő plazmamennyiséget A találmány tehát műszaki előítéletek legyőzésén alapul. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a fa-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
