200694. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás krioprecipítátum gyártására kis plazmapoolból
Hü 20ÜSS4B gyász tást legalább -20 'C-os levegő áramoltatásával, ún. alagőtfagyasztásos módszerrel, a felolvasztást vízfürdőben, 44 'C-os áramoltatott víz segítségével végezzük, a centrifugálás előtt a centrifugát -5-0 *C- ra előhűtjük és a felülúszó plazma eltávolítása előtt a plazmaprést is előhűtjük. így biztosítani tudjuk, hogy nagyobb mennyiség esetén se emelkedjen a feldolgozás során a hőmérséklet +4 *C fölé. Ezen intézkedések azt eredményezik, hogy a találmány szerinti eljárással kis-poolos szinten maradva tisztítási lépések nélkül: a) kb. 30%-kal több Vm faktor nyerhető a végtermékben, mint a szokásos egyedi krioprecipitátum gyártást követő összemosásokkal; b) a termék kb. kétszer olyan tisztaságú Vm faktorra nézve, mint a szoklásos krioprecipitátum (lásd. 1. táblázat); c) a végtermék összfehérje tartalma csökken; d) az esetek többségében éppolyan reakciómentes kezelést eredményez, mint ami a nagy tisztaságú, frakciónál! VIII faktor készítménnyel érhető el. 3 I. táblázat VHIFtarössz-VfflF talom fehérje kinyerés E g% szokásos eljárás 6 db egyedi krioprecipitátum öszszemosásával 450±140 3-6 26-46 találmány szerint 4 db-os egyesített plazmából 1000 mles zsákban 4001100 0,9-2,5 29-64 A fentiek alapján a találmány eljárás krioprecipitátum előállítására kis plazmapoolból friss vérplazma fagyasztásával, felolvasztásával és a felülúszó plazma és krioprecipitátum centrifugálással végzett különválasztásával, amely abban áll, hogy 3-6 vérplazmáját egy 800-2000 ml űrtartalmú steril műanyag transzferzsákban egyesítjük, majd a fagyasztást alagútfagyasztásos módszerrel, a felolvasztást vízfürdőben a víz áramoltatásával, a centrifugálást előhűtött centrifugában, a felülúszó eltávolítását előhűtött plazmaextraktorban végezzük. A találmány szerinti eljárást előnyösen a Medicor Tr-1000 és Tr-2000 steril transzferzsákjában végezzük. Előnyös, hogy ezek a zsákok a hazai kereskedelemben beszerezhetők és nincs szükség importból beszerezhető transzferzsákokra. A találmány szerint célszerűen úgy járunk el, hogy a vérvételtől számított max. 6 órán belül a luesra, hepatitisre és HTLV-ffl vírusra levizsgált4 db vér centrifugálása után kapott plazmát feldolgozzuk az alábbiak szerint: a kb. 900 ml plazmát tartalmazó Medicor Tr-1000 zsákot -20 ’C-os hideg levegőáramban, ún. alagútfagyasztásos módszerrel megfagyasztjuk. A következő napon a felolvasztást +4 ’C-os vízfürdőben felfüggesztve, a víz állandó áramoltatása közben kb. 2-3 óra alatt végezzük. A centrifugálást előhűtött, előnyösen -5 és 0 *C közötti hőmérsékletű centrifugában 2000-3000 furdulat/perc-cel végezzük 10 percig. A centrifugát mindenképpen célszerű előhűteni, hogy a centrifugálás időtartama alatt se emelkedjen a hőmérséklet +4 *C fölé. Ezután a krioprecipitátum csapadék és a felülúszó plazma szétválasztását +4 *C- ra előhűtött plazmaextraktorban (plazmaprés) vákuummal végezzük. A felülúszó minél tökéletesebb eltávolítását azáltal érhetjük el, hogy a plazmaprést megfordítjuk és érfogó segítségével préseljük ki a zsák falai közt maradt plazmát Az így kapott krioprecipitátumot nátrium-kloridot és trinátrium-citrátot tartalmazó oldatban feloldjuk. Ez a steril végtermék -20 ‘C alatt, fagyasztott állapotban jól eltartható. Ha liofilizátumként akarjuk tárolni, akkor a krioprecipitátumot olyan steril oldószerben oldjuk, amely a fentieken kívül glukózt is tartalmaz. A liofilitált krioprecipitátum +4 *C-on hosszabb ideig eltartható. A találmány szerinti eljárást a következő példa szemlélteti: a vérvételtől számított 6 órán belül feldolgozásra kerülő 4 db (luesra, hepatitisre és HTLVIll-ra kivizsgált) vér centrifugálása után a 4 vér plazmáját közvetlenül 1 db Medicor Tr-1000 steril transzferzsákba nyomjuk Akb. 900 ml plazmát tartalmazó zsákot -20 ’C-os hideg levegőáramban fagyasztjuk (ún. alagútfagyasztás). A következő napon +4 ’C-os áramoltatott vizet tartalmazó vízfürdőben felfüggesztve kb. 2,5 óra alatt felolvasztjuk a zsák tartalmát. Ezután -2 *C-ra előhűtött Janetzki K 70 vagy Heraeus Christ Cryofuge 8000 típusú centrifugában centrifugáljuk a krioprecipitátum csapadékot tartalmazó Ti-1000 ml-es zsákot 2500 fordVperc mellett 10 percig. Ezt követően a 44 *C-ra előhűtött plazmaprésbe helyezve a műanyagzsákot a felülúszó plazmát vákuummal megszívott steril üvegpalackba nyomjuk át A művelet végén a plazmaprés megfordításával ill. a présből kiemelt összelapult zsák falai közt maradt plazmának érfogó segítségével történő kinyomásával elősegítjük a felülúszó minél tökéletesebb eltávolítását A zsákban maradó krioprecipitátumot 80-100 ml krioprecipitátum oldószerben (1000 ml víz tartalmaz 339 g NaCl-ot és 6,19 g trinátrium-citrátot) feloldjuk, a pH-t sósavoldattal 7,0-re állítjuk és autoklávban sterilitáljuk. A feloldott krioprecipitátumot Tr- 300 steril transzferzsákba, mint végtermékzsákba engedjük át Ezt a végterméket felhasználásig -20 *C alatt-tároljuk fagyasztott állapotban. Liofilizáláshoz olyan oldószerben oldjuk a krioprecipitátumot amely a fentieken túl még literenként 12,9 g glukózt is tartalmaz, őrnek az oldatnak a pH-ját 0,1 mólos sósavoldattal 6,2-re állítjuk. A liofilizált krioprecipitátum 44 ’C-on eltartható. 4 SZABADALMI IGÉNYPONT Eljárás kis plazmapoolból krioprecipitátum előállítására a friss vérplazma fagyasztásával, felolvasztásával, majd felolvasztás utána krioprecipitátum és & felülúszó plazma centrifugálással végzett különválasztásával és elkülönítésével, azzal jellemezve, hogy 3-6 vér plazmáját egy 800-2000 ml-es steril műanyag transzferzsákban egyesítjük (poolozzuk), majd a fagyasztást alagútfagyasztásos módszerrel, a felolvasztást vízfürdőben a víz áramoltatásával, a centri-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
