200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 A találmány olyan humán plazminogén aktivátorral vonatkozik, amely megfelel az emberi vérszérumban és/vagy szövetekben található plazminogén aktivátornak. A találmány tárgyát elsősorban e plazminogén aktivátomak és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítményeknek az előállítására szolgáló eljárás képezi. A találmányt részben a humán plazminogén aktivátor DNS-szekvenciájának és az abból levezetett aminosav-szekvenciájának a meghatározása tette lehetővé. Ezeknek az ismereteknek a felhasználásával mód nyílott a humán plazminogén aktivátomak DNS-rekombinációs technológiával történő előállítására. Ezáltal olyan minőségben és mennyiségben termelhetjük ezt az anyagot, hogy kiterjedt biológiai vizsgálatok és klinikai kipróbálások indíthatók be, amelyeket nem korlátoz az ismert elkülönítési módszerekkel hozzáférhető szűkös anyagmennyiség. Az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor A fibrinoiítikus rendszer dinamikus egyensúlyban van a koagulációs rendszerrel, és ezáltal sértetlen érrendszert biztosít. A koagulációs rendszer hatására fibrin válik ki vázként, hogy vérzéscsillapítás jöjjön létre. A fibrinoiítikus rendszer eltávolítja a fibrin vázat a vérzéscsillapítás elérése után. A fibrinoiítikus folyamatot a plazmin nevű proteolítikus enzim hozza létre. A plazmin a plazminogénből képződik, amely a vérplazmában található fehérje elővegyület. A plazminogén egy aktivátor hatására bekövetkező aktiválás folytán alakul plazminná. Jelenleg két aktivátor szerezhető be a kereskedelemből: a sztreptokináz és az urokináz. Mindkettő heveny keringési megbetegedések kezelésére javallott, mint amilyen a szívizominfarktus, gutaütés, tűdőembólia, mély vénás trombózis, perifériás artériaelzáródás, valamint egyéb vénás trombózisok. Együttesen ezek a betegségek igen nagy egészségügyi veszélyforrást képeznek. Ezeknek a megbetegedéseknek az oka az, hogy valamelyik ér részlegesen - vagy súlyos esetekben - teljesen elzáródik egy vérrög - trombus vagy tromboembolus - hatására. A hagyományos antikoagulánsokkal történő gyógymód, például heparin vagy kumarin alkalmazásával, közvetlenül nem segíti elő a trumbusok vagy tromboembolusok feloldását. A korábban említett trombolítikus szerek, a sztreptokináz és az urokináz ténylegesen használatban vannak, azonban alkalmazásukkor jelentős hátrányok jelentkeznek. Az egyiknek sincs túlságosan nagy affinitása a fibrin iránt, ennek következtében viszonylag megkülönböztetés nélkül aktiválják mind a keringésben lévő, mind pedig a fibrinhez kötött plazminogént. Az áramló vérben képződő plazmin elég gyorsan semlegesítődik és elvész az értékes trombolízishez. A visszamaradó plazmin károsítja a különféle alvadásfaktor fehérjéket, például a fibrinogént, az V. faktort és a VIII. faktort, és így vérzésveszélyt hoz létre. Ezen túlmenően a sztreptokináz erősen antigén tulajdonságú, és a nagy antitest titerú betegeknél nem jelentkezik kielégítő hatás ennél a kezelésnél, és a kezelés folyamatosan nem folytatható. Az urokinázzal történő gyógykezelés költséges, mivel az urokinázt az emberi vizeletből vagy szövettenyészetből kell elkülöníteni, ezért az urokináz alkalmazása nincs általánosan elfogadva az orvosi gyakorlatban. Az urokináz számos kutatás tárgyát képezte (lásd például az 1-6. hivatkozást). Úgynevezett plazminogén aktivátorokat különítettek el különféle emberi szövetből, például a méhszövetből, a vérből és a szérumból (lásd a 7-11. hivatkozást), valamint sejttenyészetekből (94. hivatkozás). Plazminogén aktivátorokat tartalmazó készítményeket is leírtak (lásd a 12-13. hivatkozásokat). Lásd továbbá a 14-18. hivatkozásokat. A fenti eredetű plazminogén aktivátorokat két főbb csoportba sorolták: az urokináz típusú plazminogén aktivátorok (u-PA) és a szövettípusú plazminogén aktivátorok (t-PA) csoportjába. A fenti csoportosítás az immunológiai tulajdonságaik közötti különbségeken alapul. (A t-PA és u-PA rövidítéseket a trombózissal és vérzéscsillapítással foglalkozó Nemzetközi Bizottság XXVIII. ülésén javasolták, 1982 július 27-én, az olaszországi Bergamoban.) Újabban azonosítottak egy olyan emberi melanoma vonalat, amely t-PA-t választ ki. Ennek a melanoma alapú plazminogén aktivátomak a jellemzésekor kiderült, hogy sem immunológiai szempontból, sem pedig az aminosav-összetételt tekintve nem különböztethető meg a normális emberi szövetből elkülönített plazminogén aktivátortól (19, 88). A terméket viszonylag tiszta alakban különítették el, azonosították, és azt tapasztalták, hogy az erősen aktív fibrinoiítikus szer (20). A melanoma sejtvonalból elkülönített és megtisztított t-PA-t alkalmazó különféle vizsgálatok (például 95-98. hivatkozások) során kimutatták, hogy nagyobb az affinitása a fibrin iránt, mint az urokináz-típusú plazminogén aktivátoroké. Az emberi eredetű t-PA-nak mint lehetséges trombolítikus szemek a kiterjedtebb vizsgálatát gátolta azonban az, hogy rendkívül csekély koncentrációban van jelen a vérben, a szövetkivonatokban, az érrendszeren átáramoltatott folyadékokban és a sejttenyészetekben. Felismertük, hogy a DNS-rekombináció alkalmazásával rendkívül hatékonyan állíthatjuk elő a megkívánt nagy mennyiségű, jó minőségű, emberi szövettípusú plazminogén aktivátort (ezt korábban humán plazminogén aktivátomak nevezték), gyakorlatilag más emberi fehérjétől mentesen. Várhatóan az így kapott termék biológiai aktivitása lehetővé teszi a különböző keringési megbetegedések kezelésére történő alkalmazását. DNS-rekombinációs technológia A dezoxiribonukleinsav- (DNS) rekombinációs technológia meglehetős fejlettséget ért el. A molekuláris biológiával foglalkozó szakemberek viszonylag egyszerűen tudják rekombinálni a különféle DNS- szekvenciákat, új DNS-molekulákat hozva létre, amelyek bőséges mennyiségű exogén fehérje termék előállítására képesek a transzformált mikrobákban és sejttenyészetekben. Rendelkezésre állnak azok az általános módszerek, amelyekkel in vitro összekapcsolhatók a különböző „tompa’" végű vagy „tapadós” végű DNS-töredékek, és ilyen módon hatékony kifejező hordozók képződnek, amelyek felhasználhatók megfelelő organizmusok transzformálásához. Ezáltal irányíthatjuk a kívánt exogén termék hatékony szintézisét. Amikor viszont egy konkrét termék előállítása 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
