200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 a cél, a szintézis meglehetősen bonyolult, és a tudomány nem érte még el azt a szintet, amikor az eredmény előre felbecsülhető. Ha valaki kísérleti alap nélkül jósol kedvező eredményeket, azt kockáztatja, hogy az eljárása esetleg kivihetetlen. Az elengedhetetlen elemek, azaz a reprodukcióeredet, egy vagy több fenotípus kiválasztási jellemző, a kifejezési promotor, a heterológ génbetét és a visszamaradó vektor DNS-rekombinációja általában a gazdasejtén kívül történik. A létrejövő rekombinált, reprodukcióra képes kifejezőhordozót vagy plazmidot transzformállással visszük be sejtekbe, és a transzformáns tenyésztésével nagy mennyiségű rekombinált hordozót kapunk. Ha a gén beillesztése megfelelően történt azokhoz a részekhez képest, amelyek a kódolt DNS üzenet átírását és lefordítását irányítják, a létrejövő kifejező hordozóval ténylegesen kifejezhető az a polipeptid szekvencia, amelyet a beillesztett gén kódol. Ezt a folyamatot kifejezésnek nevezzük. A képződő terméket úgy különíthetjük el, hogy szükség esetén elbontjuk a gazdasejtet mikrobiológiai rendszerekben, és a terméket megfelelően megtisztítjuk a többi fehérjétől. A gyakorlatban a DNS-rekombinációs technológiával vagy teljesen heterológ polipeptideket termelhetünk - ez az úgynevezett közvetlen kifejezés -, vagy olyan heterológ polipeptidet termelhetünk, amely egy homológ polipeptidet aminosav-szekvenciájának egy részéhez kapcsolódik. Ez utóbbi esetben az előállítani kívánt, biológiailag aktív tennék néha inaktívvá válik az összekapcsolt homológ/heterológ polipeptiden belül. és a biológiai aktivitás eléréséhez el kell hasítanunk sejten kívüli környezetben. (Lásd a 21. és 22. hivatkozást.) Hasonló módon jól kidolgozottak a genetika és sejtfiziológiai vizsgálatára szolgáló sejt- vagy szövettenyészetek. Rendelkezésre állnak azok a módszerek, amelyekkel állandó sejtvonalakat tarthatunk fenn, ahol a sejtvonalak különálló normális sejtekből egymást követő sorozatos átvitelekkel készültek. A kutató munkához történő felhasználáshoz ezeket a sejtvonalakat szilárd hordozón tartjuk cseppfolyós táptalajon, vagy olyan szuszpenzióban tenyésztjük őket, amelyek tápanyagként szolgáló hordozót tartalmaznak. Úgy tűnik, hogy a nagyobb léptékű termeléshez szükséges méretnövelés mindössze gépészeti problémát jelent. A további részletekkel kapcsolatosan a (23) és (24) hivatkozások szolgálnak felvilágosítással. A fehérjével kapcsolatos biokémiai ismeretek is elengedhetetlenek a DNS-rekombinációs technológiához. A kívánt fehérjét termelő sejtek többszáz egyéb fehérjét is létrehoznak, amelyek a sejtanyagcsere endogén termékei. Ha ezeket a szennyező fehérjéket - más vegyületekkel együtt - nem távolítjuk el a kívánt fehérjéből, akkor azok toxikusnak bizonyulhatnak, amikor a gyógyászati kezelés során embernek vagy állatnak beadják. A fehérjebiokémia módszerei teszik lehetővé olyan elválasztó eljárások kidolgozását, amelyek alkalmasak a vizsgált rendszerhez, és olyan homogén terméket biztosítanak, amely biztonságosan használható a kívánt célra. A fehérjebiokémia a kívánt tennék azonosításához is szükséges, valamint ahhoz, hogy meggyőződjünk arról, hogy a sejtek hűségesen, változtatások vagy mutációk nélkül termelték. Ez a tudományág a biológiai hatásvizsgálatok, stabilitás vizsgálatok és más olyan eljárások tervezésében is szerepet játszik, amelyekre szükség van az eredményes klinikai vizsgálatok és az értékesítés előtt. A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy a DNS-rekombinációs technológia eredményesen alkalmazható az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor (t-PA) termelésére. A t-PA-t előnyösen közvetlen alakban állítjuk elő, és olyan mennyiségben, amely elegendő az állatkísérletek és az embereken történő kipróbálás elvégzéséhez. A termékként kapott humán t-PA valamennyi formájában felhasználható a különféle keringési megbetegedések megelőző vagy gyógyító kezelésére. Ezért a találmányt keringési rendellenességek t-PA alkalmazásával történő kezelésére és az ezt a terméket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására is irányul. Továbbá, a találmány az emberi szövetekben található, gyakorlatilag tiszta plazminogén aktivátorra vonatkozik. A génsebészeti úton, mikroorganizmusokkal vagy sejttenyészetekkel előállított termék lehetőséget biztosít arra, hogy a korrábbinál lényegesen nagyobb hatásfokkal állítsuk elő az emberi szövetekben található plazminogén aktivátort. Emellett, a gazdasejttől függően, a találmány szerinti humán plazminogén aktivátor kisebb vagy nagyobb mértékben glikozilezett lehet a natív anyagokhoz képest. Minden esetben a t-PA mentes azoktól a szennyező anyagoktól, amelyek a nem génsebészeti úton nyert termékben általában jelen vannak. A termelhető alakban lévő humán plazminogén aktivátort kódoló génszekvenciákat tartalmazó, reprodukcióra képes DNS-kifejező hordozók, az ezekkel transzformált mikroorganizmus törzsek vagy sejttenyészetek és a humán plazminogén aktivátor termelésére képes transzformált tenyészetek is a találmány tárgyát képezik. A találmány körébe tartoznak azok az eljárások is, amelyekkel előállíthatok a fenti génszekvenciák. DNS-kifejező hordozók, mikroorganizmus törzsek és sejttenyészetek. Az említett mikroorganizmusok és sejttenyészetek fermentációs tenyészeteinek előállítása is a találmány körébe tartozik. A találmányt az alábbi ábrák felhasználásával ismertetjük részletesen. Az 1. ábra 35S izotóppal jelzett metionint tartalmazó fehérjék 10 % nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamidgélen végzett elektroforézisének (SDS PAGE) eredményét mutatja be. A fehérjék kicsaphatok a melanoma sejtekből proteáz inhibitor jelenlétében illetve távollétében kiválasztott anti t-PA IgG-vel. A 2. ábrán melanoma sejtekből számlázó mRNS frakciók kicsapott lefordítási termékeinek elektroferézise látható. A 3. ábra kiegészítő dezoxiribonukleinsavval (cDNS) transzformált 96 baktérium tenyészet hibridizációs képét mutatja be. Mintaként 32P izotóppal jelzett 14-mer keverékét használtuk, amely a humán t-PA 5 aminosavból álló szekvenciáján alapul. A 4. ábra a teljes hosszúságú humán t-PA kiegészítő dezoxiribonukleinsavjának azokat a helyeit mutatja be, ahol a restrikciós endonukleázok hasítást végeznek. Az 5a.. 5b. és 5c. ábra a teljes hosszúságú humán t-PA kiegészítő dezoxiribonukleinsvjának nukleotid szekvenciáját és az abból levezetett aminosav-szekvenciáját mutatja be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
