200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 S2251 kromogén alapanyagtól (gyártó: Kabi Group, Inc., Greennwich, CT). Eljárás A minta alikvot részét összekevertük 0,1 ml 0,7 mg/ml koncentrációjú plazminogénnel [amely 0,05 M trisz-hidrokloridot (pH=7,4) és 0,012 M nátrium-kloridot tartalmazó oldattal készül], és a térfogatot 0,15 ml-re állítottuk be. Az elegyet 37 °C-on inkubáltuk 10 percig, hozzáadtunk 0,35 ml S2251 kromogén alapanyagot a fenti pufferrel készült 1,0 mM koncéijjrációjú oldat alakjában, és a reagáltatást 30 percig" folytattuk 37 °C-on. A reakciót 25 [ti jégecet hozzáadásával állítottuk le. A mintákat centrifugáltuk, és meghatároztuk az abszorbanciát 405 nm-nél. Az aktivitás számszerű értékét standard urokináz-oldattal végzett összehasonlítással kaptuk meg. A szövetekben található teljes hosszúságú plazminogén aktivátor meghatározásához a vizsgálati körülményeket módosítottuk, amennyiben 0,2 mg fibrinogént adtunk az oldathoz. A ftbrinogén serkenti a szövetekben található plazminogén aktivátort, ezért kissé megnövelt aktivitást eredményez. Az aktivitást viszonyított egységekben kifejezve regisztráltuk, ahol 90.000 viszonyított egység egyenlő 1 mg tisztított plazminogén aktivátor aktivitásával. A plazminképzödés közvetett vizsgálata Elméleti alapok Érzékeny vizsgálati módszert dolgoztak ki (87) a szövetekben található plazminogén aktivátor mérésére. A vizsgálat során a plazminképződést határozzuk meg oly módon, hogy mérjük a fibrinnek plazmin hatására bekövetkező feltárása mértékét fibrint és plazminogént tartalmazó agar-agar lemezen. A plazmin éles elbontási zónát hoz létre a fibrin lemezen. Az elbontási zóna területe és a mintában lévő plazminogén aktivátor mennyisége között összefüggés állapítható meg. Eljárás Granelli-Piperno és Reich (87) eljárását követtük. A lemezeket 3,5 órán át inkubáltuk 37 °C-on, és mértük az elbontási zónákat. Számszerű eredményeket standard urokináz-oldattal való összehasonlítással kaptunk. l.L. A szövetekben található plazminogén aktivátor aktivitásának kimutatása Baktériumtenyésztés és mintakészítés A pARlPA" plazmidot tartalmazó Escherichia coli teleppel beoltottunk egy kémcsőben lévő 5 ml LB táptalajt, amely 20 pg/ml ampicillint tartalmazott. A sejteket egy éjszakán át tenyésztettük 37 °C-on, majd a tenyészet egy alikvot részét 1:100 arányban hígítottunk 300 ml M9 táptalajba, amely 20 pg/ml ampicillint tartalmazott. A sejteket rázólombikban tenyésztettünk 37 °C-on 4 órán át, s az abszorbancia 550 nm-nél 0,419 lett. Ezután a triptofánnal analóg indol-akrilsavat adtunk hozzá 30 pg/ml koncentráció eléréséig. A sejteket 90 percig inkubáltuk. ekkor az abszorbancia 0,628 lett 550 nm-nél. A sejteket centrifugálással elkülönítettük, majd ismét szuszpendáltuk 0.8 ml 0.01 M trisz-oldatban (pH=8,0). amely 0.01 M etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott. A képződő szuszpenziót nagy fordulatszámmal kevertük szobahőmérsékleten 18 órán át. A mintát centrifugáltuk, és a felülúszó folyadékban meghatároztuk a szövetekben található plazminogén aktivátor aktivitását. A pt-PAtrpl2 kifejezését illetően lásd a 10. ábrával kapcsolatos részletes leírást. Az aktivitás meghatározása Az 1. és 2. táblázat azokat az eredményeket tartalmazza, amelyeket Escherichia coli extraktumokkal aktivált plazminogénnel kaptunk. Olyan aktivitás jött létre, amely függ a plazminogén jelenlététől (1. táblázat). Ezt az aktivitást nem befolyásolja a nyúl preimmun széruma, jelentősen gátolja azonban az az antiszérum, amely tisztított melanoma sejt eredetű plazminogén aktivátorral (88) szemben jött létre (1. és 2. táblázat). Ez arra mutat, hogy az Éscherichia coli extraktumok olyan plazminogén aktiváló hatást hoznak létre, amelyet gátolnak a szövetekben található plazminogén aktivátorral szembeni antitestek. A 7. ábra a fibrinolítikus aktivitás ftbrinlemezes vizsgálatának eredményét mutatja be. Standard menynyiségű urokinázt adtunk a középső sorhoz, balról jobbra 0,24; 0,14; 0,10; 0,05 és 0,02 viszonyított egység koncentrációban. Az alsó sor a szövetekben található természetes plazminogén aktivátor mintáinak felel meg, ahol mindegyik esetben azonos mennyiségű enzimet használtunk. A bemélyedések - amelyeknek az ábrán látható körök megfelelnek - balról jobbra a következő anyagokat tartalmazzák: a szövetekben található plazminogén aktivátor; anti-plazminogén aktivátor és preimmun szérum; és a szövetekben található plazminogén aktivátor a szövetekben található plazminogén aktivátor antitestekkel együtt. A felső sorban lévő bemélyedések mindegyike 8 |il rekombinációs plazminogén aktivátor Escherichia coli extraktumot tartalmaz. Az első bemélyedés csak az extraktumot tartalmazta, a második preimmun szérumot is tartalmazott, míg a harmadik bemélyedéshez plazminogén aktivátor antitesteket adtunk. Nyilvánvaló, hogy a preimmun szérum nincs kihatással a szövetekben található, természetes vagy rekombinált plazminogén aktivátorra, és a szövetekben található plazminogén aktivátor antitestek gátolják a természetes plazminogén aktivátor valamint az Escherichia coli extraktumok aktivitását. Az urokináz standard anyagok alapján az extraktumok plazminogén aktivátor tartalma valamivel kevesebb mint 2,5 viszonyított egység/ml volt. Ez jól egyezik az 1. táblázatban szereplő értékkel, amely 1,3 viszonyított egység/ml. Az 1. és 2. táblázatban adjuk meg a fenti vizsgálatok eredményeit. 1. táblázat pARIPA plazmidot tartalmazó Escherichia coli tenyészetek extraktumaival végzett plazminogénaktiválás Minta A4Ü5 Aktivitás1, % Számított viszonyított egységek/ml Extraktum (plazminogén nélkül) 0.043 (0) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
