200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 Minta A405 Aktivitás1, Számított % viszonyított egységek/ml Extraktum Extraktum + 0,451 (100) 1,3 preimmun szérum 0,477 106 _ Extraktum + anti t-PA antitestek 0,079 9 1 A százalékos aktivitást úgy számítottuk ki, hogy a kapott értékekből kivontuk a vakpróbára kapott eredményt (0,043), és elosztottuk az extraktumra kapott értékkel. 2. táblázat Plazminogénaktiválás pt-PAtrp!2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli tenyészetek extraktumaival Minta A405 Aktivitás, % Extraktum 0,657 (100) Extraktum + preimmun szérum 0,665 101 Extraktum + anti t-PA antitestek 0,059 9 A 10. ábrán fibrin lemezes vizsgálati eredményeket mutatunk be. E vizsgálatokat a szövetekben található plazminogén aktivátort termelő plazmidot tartalmazó Escherichia coli 10 liter mennyiségű fermentációs tenyészeteiből készült extraktumokkal végeztük. A szövetekben található plazminogén aktivátort tartalmazó extraktum fibrinolitikus aktivitását a 10. ábrán az A bemélyedés jelzi. Ezt a fibrinolitikus aktivitást gátolja az anti t-PA IgG (C bemélyedés), nem gátolja azonban a pneimmun IgG (B bemélyedés) vagy az anti urokináz IgG (D bemélyedés). Nem tapasztaltunk aktivitást egy olyan extraktumnál, amely kontrollként a pLeIFAtrpl03 leukocita interferon plazmidot tartalmazó sejtekből készült (H bemélyedés). 2. A szövetekben található plazminogén aktivátor termelése a metotrexát iránt kis kötési affinitással rendelkező DHFR fehérje alkalmazásával 2.A. A vektor kialakítása Az emberi szövetekben található plazminogén aktivátort (t-PA) kódoló szekvenciát beillesztettük egy olyan kifejező plazmidba, amely DHFR mutánst tartalmazott. Ez utóbbi csekély kötési affinitással rendelkezik a metotrexát iránt is, és az 1983 január 19-én benyújtott, 499 151 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésünkben írtuk le, amely megfelel a 117 060 sz. publikált európai szabadalmi bejelentésnek. Az alábbiak szerint jártunk el (lásd all. ábrát): Három töredéket készítettünk a következő átlapolódó t-PA plazmidokból: pPA25E10. pPA17, pt-PAtrp 12. A pPA17 plazmidot feltártuk Dde I enzimmel, kitöltöttük Klenow DNS polimeráz I alkalmazásával, és elvágást végeztünk Pst I enzimmel. Elkülönítettük az ilyen módon képződött, mintegy 200 bázispárból álló töredéket, amely 5’ végződésű t-PA szekvenciát tartalmazott. A második t-PA töredéket úgy állítottuk elő, hogy ph-PAtrp 12-t feltártunk Pst I és Nar I enzimekkel, s elkülönítettük a közelítőleg 310 bázispárból álló töredéket A harmadik t-PA töredékhez úgy jutottunk, hogy pPA25E10 plazmidot feltártunk Nar I és Bgl II enzimekkel, és elkülönítettük a mintegy 1645 bázispárból álló töredéket, amely a t-PA-t kódoló tartomány jelentős részén kívül 3’ lefordítatlan szekvenciákat is tartalmazott. A HBV felületi antigént termelő pE342 plazmidot (amelyet pHBs348-E elnevezéssel is illetnek) Levinson és munkatársai írták le az 1981 december 3-án benyújtott, 326 980 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amely a 73 656 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentésnek felel meg. Röviden, az SV40 Simian vírus eredetét úgy különítettük el, hogy SV40 DNS-t feltártunk Hind III enzimmel, és a Hind III végeket átalakító (AGCTGAATTC) hozzáadásával EcoRI végekké alakítottuk. Ezt a DNS-t elhasítottuk PvuII enzimmel, és Rí összekapcsolókat adtunk hozzá. EcoRI enzimmel végzett feltárás után a eredetet átfogó, 348 bázispárból álló töredéket poliakrilamid gél elektroforézissel és elektroelúcióval különítettük el, s pBR322 plazmidba klónoztuk. A pHBs348-E kifejező plazmidot úgy építettük fel, hogy a FŰ3V-nek EcoRI és BglII enzimek segítségével végzett feltárásával nyert. 1986 bázispárból álló töredéket [Animal Vírus Genetics, 5. fejezet, Acad. Press, N. Y. (!980)J (amely átfogja a HBsAg-t kódoló gént) a pML plazmidba klónoztuk [Lusky és munkatársai. Nature, 293, 19 (1981)] az EcoRI és BamHI helyekre. (A pML plazmid a pBR322 plazmidnak egy olyan származéka, amelyből törölve lettek a plazmid reprodukcióját majomsejteken gátló szekvenciák). A kapott plazmidot (pRI-Bgl) ezután lineárissá tettük EcoRI alkalmazásával, és az SV40 eredetét tartalmazó részt képviselő, 348 bázispárból álló töredéket bevittük a pRI-Bgl EcoRI helyére. Az eredetet tartalmazó töredék bármelyik irányítottsággal beilleszkedhet. Mivel ez a töredék a reprodukció eredetén túlmenően a korai és késői SV40 promotorokat is kódolja, a HBV gének akár a korai, akár a késői promotor irányításával termelhetők ettől az irányítottságtól függően (a pHBS348-E jelölés a korai promotor irányításával termelt HBs-t jelenti). A pE342 plazmidot úgy módosítottuk, hogy részlegesen feltártuk EcoRI enzimmel, kitöltöttük az elhasított helyet Klenow DNS polimeráz I alkalmazásával, és ismét összekapcsoltuk a plazmidot. eltávolítva ezáltal a pE342 plazmidból az SV40 reprodukcióeredetet megelőző EcoRI helyet. A kapott plazmidot, amelynek jelzése pE342ARl. feltártuk EcoRI enzimmel, kitöltöttük Klenow DNS polimeráz I alkalmazásával, és hasítást végeztünk Bam Hl enzimmel. Poliakrilamid gélen végzett elektroforézis után elektroelúcióval elkülönítettük a mintegy 3500 bázispárból álló töredéket, fenollal és kloroformmal extraháltuk, és etanollal kicsaptuk. a fentebb már ismertetett módon. Az ilyen módon előállított. 3500 bázispárból álló p342E vektort, valamint a fentebb lein t-PA töredéke5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
