200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 majd szekvencia-analízist végeztünk. Ez utóbbi kimutatta, hogy az egyik klón (pPA17) tartalmazza a szövetekben található plazminogén aktivátor helyes 5’ nitrogén-csoportú tartományát, tartalmaz továbbá egy jel vezető szekvenciát és egy 84 bázispárból álló, 5’ lefordítatlan részt. A két klónból - pPA25E10 és pPA17 - meghatároztuk a szövetekben található, teljes hosszúságú plazminogén aktivátor kiónjának teljes nukleotid szekvenciáját (5. ábra) és a restrikciós képét (4. ábra). A szövetekben található natív plazminogén aktivátor molekulát 17 diszulfidhíddal stabilizálhatjuk a többi szerint proteázzal fennálló homológ jelleg alapján. Négy lehetséges N-glikozileződési helyet tartalmaz, ezek közül három a „kringle” tartományokban helyezkedig el asnii7, asm 84 és asnzis helyeken, egy pedig a könnyű láncú tartományban, asn44S helyen. Az oligoszaccharid ligandumok szerkezetében fennálló eltérések okozhatják az eltérő molekulaformákat (65.000 és 63.000 molekulasúlyú anyagok). 1.1. A szövetekben található, teljes hosszúságú plazminogén aktivátor cDNS kiónjának közvetlen termelése Escherichia coli törzsben A teljes kódoló szekvencia helyreállítására a közös Hhal restrikciós endonukleáz hely alkalmazásával nyílt mód, amely helyet mindkét részklón (pPA17 és pPA25E10) tartalmazza Az 5-23. számú aminosavaknak megfelelő, 55 bázispárból álló Sau3AI - Hhal restrikciós töredéket különítettünk el a pPA17 plazmidból. A Sau3AI restrikciós hely a feltételezett érett kódoló szekvencia 4. számú kodonján volt található, és felhasználtuk a jelpeptidet kódoló tartomány eltávolítására. Egy 263 bázispárból álló, a 24-110. aminosavakat kódoló Hhal - NarI töredéket is elkülönítettünk a pPA25E10 plazmidból. Két szintetikus dezoxioligonukleotidet alakítottunk ki, amelyek helyreállították az 1-4. számú aminosavakra vonatkozó kodonokat, tartalmaztak egy ATG lefordításkiváltó kodont, és létrehoztak egy EcoRI kohéziós láncvéget. Ezt a három töredéket ezután összekapcsoltuk, és ily módon egy 338 bázispárból álló töredéket kaptunk, amely az 1-110. aminosavakat kódolja. Ezt a töredéket és egy, a pPA25E10 klónokból származó, 1645 bázispárból álló Narl-BglII töredéket összekapcsoltuk pLeIFAtrpl03 plazmid (53) EcoRI és BglII helyei között, s így a pt-PAtrpl2 termelő plazmidot kaptuk. A klónozott t-PA gén átírása az Eschrichia coli törzs trp operonja egy 300 bázispárból álló töredékének irányításával történik. Ez tartalmazza a trp promotort, operátort és a trp vezető peptid Shine-Dalgamo szekvenciáját, hiányzik azonban belőle a vezető peptid ATG beindító kodonja (52). A pt-PAtrpl2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110 törzset (ATCC 27325) tenyésztettük, és extraktumokat készítettünk a fibrinolítikus aktivitás vizsgálatához. A szövetekben található plazminogén aktivátor aktivitásának mérésére szolgáló egyik módszer a fibrinlemezes vizsgálat (87). Ennél a plazminképződés mértékét határozzuk meg oly módon, hogy mérjük a fibrinnek plazmin hatására bekövetkező feltárását olyan agaróz lemezen, amely plazminogént és fibrint tartalmaz. A plazmin éles elbontási zónát hoz létre a fibrinlemezen. és ennek a zónának a nagysága összefüggésbe hozható a mintában lévő plazminogén aktivátor mennyiségével. Amikor a pt-PAtrpl2 klónokból nyert extraktumok plazminogén aktivátor aktivitását vizsgáljuk a fibrinlemezes módszerrel, nyilvánvaló és éles elbontási zóna jelenléte. Ezt a fibrinolítikus aktivitást gátolja az anti t-PA IgG, nem gátolja azonban a preimmun IgG vagy az anti-urokináz IgG, és nem tapasztalható aktivitás olyan extraktumnál, amely kontrollként a pLeIFAtrpl03 leukocita interferon plazmidot tartalmazó sejtekből készült. A tisztított t-PA segítségével felvett standard görbe alkalmazásával megállapítható, hogy az extraktum aktivitása közelítőleg 20 egység/109 sejt. (A tisztított t-PA-nál 90.000 viszonyított egység = 1 mg) (10. ábra). l.J. Szekvencia analízis A szekvencia analízis az Edman-féle lebontáson (83b) alapult. A mintát Beckman 890B vagy 890C típusú, forgócsészés szekvenciameghatározó készülék csészéjébe vittük be. A csészében vivőanyagként PolybreneTM (poliN,N,N’,N'-tetrametil-N-trimetilén-hexametilén-diammónium-diacetát) szolgált (63C). A szekvenciameghatározó készüléket hűtött csapdával módosítottuk, és némi programváltoztatást is tettünk a háttérzaj csökkentésére. A reagensek a következők voltak: Beckman-féle szekvenciameghatározáshoz megfelelő minőségű 0,1 mólos Quadrol puffer [N,N,N\N\-tetrakisz(2-hidroxi-propil)-etilén-diamin-trifluor-ecetsav puffer], fenil-izotiocianát és heptafluor-vajsav. Az összegyűjtött Edman-ciklusokat manuálisan alakítottuk 2-aniIino-5-tiazolinon-származékokká. Az 1- -klór-butánt nitrogén alatt szárítottuk. Ezután 1,0 n vizes sósav-oldatot adtunk a 2-anilino-5-tiazolinonnoz, és 10 percig 70 °C-on tartottuk. Ilyen módon 3-fenil-2-tiohidantoint (PTH-származék) kaptunk. A PTH-aminosav maradékot 50 %-os vizes acetonitrilben oldottuk, és fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfba fecskendeztük. Minden egyes PTH-aminosavat úgy azonosítottunk, hogy összehasonlítottuk egy standard PTH-aminosavelegy retenciós idejével. A standard elegyet hasonló módon kezeltük, mint a vizsgált anyagot. l.K. A szövetekben található plazminogén aktivátor termelésének kimutatására szolgáló vizsgálatok A plazminképződés közvetlen vizsgálata Elméleti alapok A szövetekben található plazminogén aktivátor érzékenyen vizsgálható oly módon, hogy követjük a plazminogénnek a szövetekben található plazminogén aktivátor által katalizált átalakulását plazminná. A plazmin enzim, amely kromogén alapanyag felhasználásával mérhető. A meghatározás egy tripeptidnek egy kromofór csoporttól történő proteolítikus elhasadásán alapul. A hasadás mértéke egyenesen arányos a vizsgált proteáz specifikus voltával és a koncentrációjával. A vizsgálat alapja az, hogy a szövetekben található plazminogén aktivátort tartalmazó oldatot plazminogén-oldattal inkubáljuk, majd meghatározzuk a képződött plazmin mennyiségét. Minél nagyobb az aktivátor mennyisége, annál több plazmin képződik. A plazmint úgy mérjük, hogy ellenőrizzük az elhasadását az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
