200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 l.H. A szövetekben található, teljes hosszúságú plazminogén aktivá tor cDNS a) A szövetekben található plazminogén aktivátor nitrogénvégcsoportú szekvenciáit tartalmazó telepkészlet előállítása 0,4 pg mennyiségű 5’ TTCTGAGCACAGGGCG 3’ szintetikus oligonukleotidot felhasználtunk 7,5 pg mennyiségű, 8. számú gélfrakció mRNS (lásd fentebb) indukálásához. hogy ismert módon (65,66) cDNS kettős spirált állítsunk elő. A cDNS-t a méret szerint frakcionáltuk 6 %-os poliakrilamid gélen. A 300 bázisárnál nagyobb méretfrakciót (36 ng) különítettük ePelektroelúcióval. 5 ng cDNS-t meghosszabbítottunk dezoxi(C) maradékokkal, láncvégi dezoxieitidil transzferáz alkalmazásával (67), és összekapcsoltuk 50 ng pBR322 plazmiddal (68), amelyet előzetesen hasonló végződésűvé alakítottunk dezoxi(G) maradékokkal a Pst I helyen (76). Az elegyet azután Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk. Mintegy 1500 transzformánst kaptunk. b) Emberi genóm DNS Southern-hibridizálása Mivel a cDNS indukciós reakcióhoz olyan szintetikus töredéket használtunk, amely pPa25E10 klón nitrogén-végcsoportú részéből 13 bázispárt hibridizált. nem állt rendelkezésre alkalmas restrikciós töredék ebben a 29 bázispárból álló tartományban a cDNS kiónok kiszűréséhez. Ezért szükség volt arra, hogy egy, az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor genóm kiónt különítsünk el, és ezzel azonosítsuk a plazminogén aktivátor nitrogén-végcsoportú kódoló szekvenciáit tartalmazó, indukáló résszel meghosszabbított cDNS kiónokat. Az eljárás első lépésében megállapítottuk, hogy az emberi genóm cDNS-ben mindössze egy homológ plazminogén aktivátor gén van jelen. Ennek meghatározására Southern-hibridizációt végeztünk. Ennél az eljárásnál (77) 5 jug nagy molekulasúlyú humán limfocita DNS-t - amelyet a (80) szerint állítottunk elő - teljesen feltártunk különféle restrikciós endonukleázokkal, elektroforézisnek vetettük alá 1,0 %-os agaróz géleken (81), és nitrocellulóz szűrőre (77) vittük át. 32P izotóppal jelzett DNS mintát készítettünk (76) a pPA25E10 plazmid cDNS betétjének 5’ végéből (230 bázispárból álló, Hpa II - Rsa I töredék), és hibridizáltuk (82) a nitrocellulóz szűrővel. A minta 35 x 106 beütés/perc izotóptartalmú mennyiségét 40 órán át hibridizáltuk, majd a szakirodalomban leírt módon (82) mostuk. Két endonukleázos feltárás csak egyetlen hibridizáló DNS töredéket szolgáltatott: Bgl il (5700 bázispár) és Pvu II (illetve 4200 bázispár). Két hibridizáló DNS töredéket figyeltünk meg a Hinc II enzim alkalmazásakor (5100 illetve 4300 bázispár). Együttesen ezek az adatok arra mutatnak, hogy az emberi genómban csak egyetlen plazminogén aktivátor gén van jelen, és ez a gén legalább egy közbeavatkozó szekvenciát tartalmaz. c) Az emberi lambda fág készlet átválogatása a szövetekben található plazminogén aktivátor gének szempontjából A szövetekben található plazminogén aktivátor géneket hordozó lambda fág rekombinánsokat oly módon azonosítottuk, hogy a pPA25E10 plazminogén aktivátor cDNS-ből készített radioaktív mintával kimutattuk a nukleotid homológ jellegét. Egymillió rekombinált lambda fágot készítettünk DP 50 Sup F táptalajon 10.000 pfu/15 cm (pfu: plagne-forming unit = telepképző egység) lemez sűrűségénél, és minden egyes lemezhez nirtrocellulóz szűrő másolatokat készítettünk Benton és Davis módszerével (78). 32P izotóppal jelzett DNS mintát készítettünk a szokásos módszerekkel (83) egy 230 bázispárból álló Hpa II - Rsa I töredékből, s 34 bázispárt lokalizáltunk a pPA25E10 plazmid 5’ végétől. Minden egyes nirocellulóz szűrőt előhibridizáltunk 42 °C-on 2 órán át 50 mM nátriumfoszfátból (pH=6,5), 5x SSC-ből (77), 0,05 mg/ml, ultrahanggal kezelt lazacsperma DNS-ből, 5x Denhardt-oldatból (84) és 50 % formamidból álló elegyben, majd 50 x 106 beütés/perc izotóptartalmú jelzett mintával hibridizáltunk ugyanebben az oldatban, amely 10 % nátrium-dextrán-szulfátot is tartalmazott (85). Egy éjszakán át 42 °C-on végzett inkubálás után a szűrőket négyszer mostuk 50 °C-on, 0,2x SSC-vel, 30 percig 0,1 %-os SDS oldattal és egyszer 2 x SSC-vel szobahőmérsékleten, majd Kodak XR-5 röntgenfilmet exponáltunk egy éjszakán át Dupont Cronex erősítő szűrők alkalmazásával. Összesen 19 kiónt kaptunk, amelyek hibridizáltak a mintával. A fág DNS-t a korábban ismertetett módon (86) készítettük el 6 rekombinánsból. A lambda klón C-t választottuk ki egy Pvu II töredék készítéséhez a tenyészet átvizsgálása számára. 30 pg DNS-t feltártunk Pvu II enzimmel 1 órán át 37 °C-on, és elektroforézist végeztünk 1,0 %-os agaróz géleken. Egy olyan, 4200 bázispárból álló töredéket különítettünk el elektroelúcióval és tisztítottuk, amelyről korábban kimutattuk, hogy a szövetekben található plazminogén aktivátor szekvenciákat tartalmaz. 32P izotóppal jelzett mintát készítettünk a szokásos módszerekkel (83) az alábbiakban leírt tenyészethibridizációkhoz. d) A tenyészetkészlet átvizsgálása a szövetekben található plazminogén aktivátor 5’ szekvenciái szempontjából A tenyészeteket nitrocellulóz szűrőkre vittük át, és azokon tenyésztettük, majd mindegyik tenyészetből a DNS-t a szűrőhöz rögzítettük a Grunstein-Hognes módszerrel (69). 32P izotóppal jelzett mintát készítettünk oly módon, hogy borjú-csecsemőmiriggyel indukáltunk (83) a szövetekben található plazminogén aktivátor elkülönített lambda genóm klónjából származó, 4200 bázispárból álló egyik Pvu II töredéket. Az 1500 transzformánst tartalmazó szűrőket 112 x 106 beütés/perc izotóptartalmú, 32P izotóppal jelzett genóm Pvu II töredékkel hibridizáltuk. A hibridizálást 16 órán át végeztük a Fritsch és munkatársai (82) által leírt körülmények között. A szűrőket jól átmostuk, majd Kodak XR-5 röntgenfilmeket exponáltunk velük 16-48 órán át, Dupont Lightning-Plus erősítő szűrők alkalmazásával. Tizennyolc tenyészet láthatóan hibridizált a genóm mintával. E tenyészetek mindegyikéből elkülönítettük a plazmid DNS-t, a nitrocellulóz szűrőkhöz kapcsoltuk azokat, és az eredeti indukáló reakióhoz használt, 32P izotóppal jelzett szintetikus oligonukleotiddal (16- -mer) hibridizáltuk. A 18 klón közül 7 hibridizált. A töredékeket az ml3 mp7 vektorba (73) alklónoztuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
