200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 adatok és a modell felhasználásával különféle lehetséges mintákat lokalizáltunk. l.F. A szövetekben található plazminogén aktivátor cDNS-szekvenciáit tartalmazó, bakteriális eredetű kiónok azonosítása A tenyészeteket külön-külön bevittük mikrotitráló lemezek bemélyedéseibe, amelyek LB táptalajt (93) és 5 pg/ml tetraciklint tartalmaztak, s 7 %-os dimetil-szulfoxid-koncentráció beállítása után -20 'C-on tároltuk ezeket. A telepkészletből két másolatot tenyésztettünk nitrocellulóz szűrőn, és mindegyik telepből a DNS-t a Grunstein Hogness eljárással (69) a szűrőhöz rögzítettük. A 32P izotóppal jelzett TC(q)CA(q)TA(^)TCCCA mintát a fentebb ismertetett módon állítottuk elő a szintetikus oligomerből (W-E-Y-C-D) (14-mer keverék). A 4600 transzformánst tartalmazó szűrőket előhibridizáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten egy olyan eleggyel, amely 50 mM nátrium-foszfátot (pH = 6,8), 5x SSC-t (80), 150 pg/ml ultrahanggal kezelt lazacsperma DNS-t, 5x Denhardt-oldatot (85) és 10 % formamidot tartalmazott. Ezután hibridizálást végeztünk ugyanebben az oldatban az izotóppal jelzett minta 50 x 106 beütés/perc mennyiségével egy éjszakán végzett inkubálás után a szűrőket háromszor mostuk szobahőmérsékleten 6x mennyiségű SSC-vel, 0,1 %-os nátrium-dodecil-szulfáttal 30 percig, egyszer 2x mennyiségű SSC-vel. és 16 órán át exponáltunk a szűrőkkel Kodak XR-5 röntgenfilmet Dupont Lightning Plus erősítő szűrők alkalmazásával. A plazmid DNS-t gyors módszerrel (71) különítettük el az összes olyan tenyészetből, amely pozitív hibridizációs reakciót mutatott. Az ezekből a klónokból nyert cDNS betétek szekvenciáit meghatároztuk, miután töredékeket alklónoztunk az M13 vektor mp 7-be (73) és a Maxam Gilbert kémiái eljárást (74) alkalmaztuk. A 3. ábrán látható a 25. számú szűrő, amely egy pozitív plazminogén aktivátor klón hibridizációs képét mutatja. A 25E10 kiónban lévő cDNS betétről kimutattuk, hogy ez a szövetekben lévő plazminogén aktivátort kódoló DNS. Ennek kimutatása úgy történt, hogy összehasonlítottuk az aminosav-szekvenciáját azzal a peptid-szekvenciával (lásd fentebb), amelyet a szövetekben található, tisztított plazminogén aktivátorból kaptunk, továbbá megvizsgáltuk az Escherichia coli törzs által kifejezett termékét (ezt később részletezzük). A 25E10 klón cDNS betétje (pPA25E10 plazmid) 2304 bázispár hosszúságú volt, a leghosszabb nyitott leolvasó keret 508 aminosavból álló fehérjét (molekulasúly 56756) kódolt, és egy 772 bázispárból álló, 3’ lefordíthatatlan tartományt tartalmazott. Ebből a cDNS kiónból hiányzottak az N-terminális kódoló szekvenciák. l.G. Az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor klón közvetlen termelése Escherichia coli törzsben Hivatkozva a 6. ábrára. 50 pg pPa25E10 plazmidot (lásd fentebb) feltártunk Pst I enzimmel, és a 376 bázispárból álló töredéket 6 %-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel különítettük el. E töredék mintegy 3 pg mennyiségét nyertük ki a gélből elektroelúcióval, 1 órán át tártuk fel 30 egység Dde I enzimmel 37 °C-on, fenollal és kloroformmal extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A képződött Dde I tapadós végeket tompa végekké hosszabbítottuk meg oly módon, hogy 5 egység DNS polímeráz I (Klenow töredék) és 0,1-0,1 mM dATP, dCTP, dGTP és dTTP hozzáadása után a reakcióelegyet 4 "C-on inkubáltuk 8 órán át. Fenollal és kloroformmal extraháltuk, majd a DNS-t 2 órán át tártuk fel 15 egység Nar I segítségével, és a reakcióelegyet elektroforézisnek vetettük alá 6 %-os poliakrilamid gélen. Körülbelül 0,5 pg mennyiséget kaptunk a kívánt, 125 bázispárból álló, tompa végű Nar I töredékből. Ez a töredék kódolja a szövetekben található, érett, teljes hosszúságú plazminogén aktivátor fehérje 69-110. számú aminosavját. A 1645 bázispárból álló Nar I - Bgl II töredék elkülönítéséhez 30 pg pPA25E10 plazmidot feltártunk 30 egység Nar I és 35 egység Bgl II enzimmel 2 órán át 37 °C-on, majd a reakcióelegyet elektroforézisnek vetettük alá 6 %-os poliakrilamid gélen. A kívánt, 1645 bázispárból álló Nar I - Bgl II töredéknek mintegy 6 pg mennyiségét nyertük ki. A pdeltaRISRC plazmid a pSRCexló plazmidnak (79) olyan származéka, amelyből a trp promoter közelében lévő és az SRC géntől távoli Eco RÍ helyek el lettek távolítva DNS polimeráz I enzimmel (28) való párképzéssel, és az Xba I hely közvetlen szomszédságában megmaradt Eco Rí helyre be lett illesztve az AATTATGAATTCAT önkiegészítő oligodezoxinukleotid, amelynek szintézise a foszforsav-triészteres módszerrel (75) történik. 20 pg pdeltaRISRC plazmidot teljesen feltártunk Eco RÍ enzimmel, fenollal és kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsaptuk. A plazmidot ezután 100 egység SÍ nukleázzal tártuk fel 16 °C-on 30 percig egy olyan elegyben, amely 25 mM nátrium-acetátot (pH=4,6), 1 mM cink-kloridot és 0.3 M nátrium-kloridot tartalmazott. Ilyen módon ATG szekvenciával rendelkező tompa véget alakítottunk ki. Fenolos és kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t feltártuk Bam Hl enzimmel, elektroforézisnek vetettük alá 6 %-os poliakrilamid gélen, és elektroelúcióval kinyertük a nagy (4300 bázispárból álló) vektortöredéket. A kifejező plazmidot úgy állítottuk össze, hogy összekapcsoltunk 0,2 pg 4300 bp vektortöredéket, 0,06 pg, 125 bázispárból álló, tompavégű Nar I töredéket és 0,6 pg, 1645 bázispárból álló Nar I - Bgl II töredéket 10 egység T4 DNS ligázzal. Az összekapcsolást 7 órán át végeztük szobahőmérsékleten, és a terméket felhasználtuk Escherichia coli 294 törzs (ATCC 31446) transzformálására, ampicillinnel szembeni rezisztencia biztosítására. 26 telepből előállítottuk a plazmid DNS-t, s feltártuk Xba I és Eco Rí enzimekkel. E plazmidok közül tizenkettő tartalmazta a kívánt, 415 bázispárból álló Xba I - Eco Rí töredéket és a 472 bázispárból álló Eco Rí töredéket. A DNS-szekvencia analízise igazolta, hogy számos fenti plazmid tartalmazott olyan ATG beindító kodont, amely megfelelően helyezkedett el a 69. számú aminosav (szerin) kezdetén. E plazmidok egyikét - pARIPA' - megvizsgáltuk, és felhasználásával a kívánt plazminogén aktivátort kaptuk (7. ábra). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
