200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 az összes RNS-től (54). 10 g melanoma sejttenyészetből általában 5-10 mg összes RNS-t és 50-200 mikrogramm PolyA+ mRNS-t kaptunk. 200 pg PolyA+ mRNS-t karbamid-agaróz géleken keresztül végzett elektroforézissel frakcionáltunk (56). A nyúlós agaróz gél (57, 58) 1,75 % agarózból, 0,025 M nátrium-citrátból (pH = 3,8) és 6 M karbamidból állt. Az elektroforézist 7 órán át végeztük 25 mA áramerősséggel, 4 °C-on. A gélt ezután borotvapengével szétdaraboltuk (frakcionálás). Az egyes szeleteket megömlesztettük 70 °C-on, kétszer extraháltuk fenollal és egyszer kloroformmal. A frakciókat ezután etanollal kicsaptuk, majd in vitro lefordítással vizsgáltuk nyúl retikulocitalizátum rendszerben [Bethesda Research Láb. (59, 60)], amelyet kiegészítettünk kutya pankreász mikroszómákkal. A lefordításokat 25 pCi 3%-metionin és minden egyes gélszeletnél 500 ng RNS alkalmazásával végeztük 30 pl végső térfogatban, amelyben 25 mM HEPES, 48,3 mM kálium-klorid, 10 mM kreatin-foszfát volt jelen, továbbá 19 különféle aminosav, mindegyik 50 mM koncentrációban, 1,1 mM magnézium-klorid, 16,6 mM etiléndiamin-tetraecetsav, 0,16 mM ditiotreitol, 8,3 mM hemin, 16,6 pg/ml kreatin-kináz, 0,33 mM kalcium-klorid. 0,66 mM EGTA és 23,3 mM nátrium-ki őri d. Az inkubálást 30 °C-on 90 percig végeztük. A kutya pankreász mikroszóma membránokat nyers mikroszómákból készítettük, etilén-diamin-tetraecetsavval távolítva el a riboszómákat (61), és nukleázzal kezeltük őket a (62) helyen leírtak szerint. A lefordítási elegyben a membránok 7 A26O egység/ml koncentrációban voltak jelen. A lefordítási termékeket vagy az immunológiai úton kicsapott lefordítási termékeket 10 %-os poliakrilamid gélen nátrium-dodecil-szulfátban végzett elekroforézissel analizáltuk a korábban ismertetett módon (63). A megfestetlen nyúlós géldarabokat rögzítettük, megszántottuk és fluorográfiás vizsgálatnak vetettük alá (64). Az egyes gélfrakciókból kapott lefordítási termékeket immunológiai úton kicsaptuk a nyúl antihumán plazminogén aktivátorra specifikus IgG alkalmazásával. Az egyik főbb, immunológiai úton kicsapott polipeptid sávot a 7. és 8. számú RNS frakciók (21-24S vándorlás) lefordításánál figyeltük meg, molekulatömege körülbelül 63.000 dalton volt. Ezt a sávot nem figyeltük meg, amikor preimmun IgG-t használtunk az immulógiai kicsapáshoz. Ez arra mutat, hogy ezek a polipeptidek specifikusak a szövetekben található plazminogén aktivátorra. l.D. A szövetekben található plazminogén aktivátor szekvenciáit tartalmazó tenyészetkészlet előállítása A gélen frakcionált mRNS (a 7. számú gélszeletben lévő mRNS) 5 pg mennyiséget használtuk fel a cDNS kettős spirál ismert módon történő előállításához (52, 65, 66). A cDNS-t 6 %-os poliakrilamid gélen frakcionáltuk a méretnek megfelelően. A több mint 350 bázispár hosszúságú cDNS-t különítettük el elektroelúcióval, mennyisége 125 ng volt. 30 ng cDNS-t meghosszabítottunk dezoxi (C) maradékokkal láncvégi dezoxinukleotidil-transzferáz (67) alkalmazásával, és 300 ng mennyiségű pBR322 plazmiddal (68) összekapcsoltuk. Ez utóbbit hasonló végződésűvé alakítottuk dezoxi (G) maradékokkal a Pst 1 helyen (67). A reakcióelegyet ezután Escherichia coli K-12 294 törzsbe (ATCC 31446) transzformáltuk. Mintegy 4600 transzformánst kaptunk. l.E. DNS minta előállítása Az emberi szövetekben található, tisztított plazminogén aktivátort ismert eljárással (19, 20) állítottunk elő. Az alábbiak szerint határoztuk meg a molekulának azokat a részeit, amelyek a leginkább alkalmasak szintetikus minták készítéséhez: Ahhoz, hogy a fehérjéket tripszinnel jobban feltárhatóvá tegyük, redukáltuk és karboximetileztük őket. A szövetekben található plazminogén aktivátor 2 mg mennyiségű mintáját először dialízisnek vetettük alá, 0,01 %-os Tween 80-val szemben, egy éjszakán át, szobahőmérsékleten. A liofilizált fehérjét azután 12 ml 8 mólos karbamid-oldatban oldottuk, amely 0,56 M trisz-hidroklorid puffert (pH = 8,6) és 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott. A diszulfid-kötéseket 0,1 ml béta-merkapto-etanol hozzáadásával redukáltuk. Ezt a reakciót nitrogén atmoszférában viteleztük ki, 2 óra alatt 45 °C-on. A redukált diszulfidokat a karböximetil-származékká alkileztük 1,0 ml 1,4 M jódecetsav (1 n nátrium-hidroxidot tartalmazó oldat) hozzáadásával. A reagáltatást 20 percig végeztük szobahőmérsékleten, majd a reakciót 0,01 % Tween 80-val szembeni dialízissel megállítottuk. A dialízist 18 órán át folytattuk szobahőmérsékleten, s a terméket liofilizáltuk. A kapott, liofilizált, karboximetilezett fehérjét újra feloldottuk 3 ml 0,1 M foszfát pufferben (pH = 7,5), tripszint (TPCK) adtunk hozzá (1:50 arányban), és 37 °C-on feltártuk. A feltárási reakcióelegyből 3 óra, 6 óra és 12 óra elteltével vettünk 0,1 ml térfogatú mintát. 12 óra elteltével ismét hozzáadtunk tripszint. 24 óra múlva megállítottuk a reakciót a reakcióelegy megfagyasztásával. Ezt addig végeztük, amíg a minta bevihetővé nem vált a nagynyomású folyadékkromatográfba. A feltárás előrehaladását nátrium-dodecil-szulfát gélekkel végzett vizsgálattal követtük a közben vett mintákon. Csupán a 3 óra elteltével vett mintánál tapasztaltunk halvány sávot a gélen. Ez arra mutatott, hogy a 24 órás feltárás teljes volt, és nagy peptidek nem maradtak vissza. Körülbelül 0,5 ml mintát fecskendeztünk be egy nagy feloldóképességű Altex C-8 oszlopba (amely 5 pm méretű golyókkal volt töltve) két menetben. Fokozatosan növeltük az acetonitril koncentrációgrádienst (1 %-ról 5 %-ra 5 perc alatt, 5 %-ról 35 %ra 100 perc alatt és 35 %-ról 50 %-ra 30 perc alatt). A két preparatív átvezetés egyikében az elúcióval kapott oldatot két hullámhosszúságon (210 nm és 280 nm) ellenőriztük. Az ezen a két hullámhosszúságon mért abszorpciók hányadosával jeleztük a triptofán-tartalmú peptidek jelenlétét. Először azoknak a csúcsoknak határoztuk meg a szekvenciáját, amelyeknél valószínű volt a triptofántartalom, vagy egyéb okokból tűntek értékeseknek. Ez az eljárás lehetővé tette, hogy a triptofán legnagyobb részénél meghatározzuk a szekvenciát. Miután mintegy 25 legjobb peptidcsúcshoz tartozó frakció szekvenciáját megállapítottuk, egyesítettük az egymással összefüggő szekvencia adatokat. Ilyen módon egy előzetes modellt kaptunk a szövetekben található plazminogén aktivátor elsődleges szerkezetéről. Az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
