200611. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-prekurzorok diszulfidhíd-képzéssel történő előállítása során kapott reakcióelegyek feldolgozására, a helytelen rekombinánsok hasznosításával
1 HU 20061 IB 2 beállítása valamely fiziológiailag ártalmatlan felületaktív anyagot adunk, mert ezáltal csökkenthetjük az oldatban maradó helyes rekombinánsnak a csapadék alakjában kiváló helytelen rekombinánsok felületén való esetleges adszorbeáldódását, és így kiküszöbölhetünk vagy legalább is csökkenthetünk egy esetleges veszteségforrást az eljárás során. Erre a célra előnyösen polietilén-glikol vagy polipropilén-glikol típusú felületaktív anyagokat, különösen (Hl) általános képletű polimereket - ahol X 2-3 szénatomos alkoxicsoportot, R1 és R2 hidrogénatomot képvisel, n jelentése egész szám 4 és 80, előnyösen 15 és 45 között, azzal a megszorítással, hogy a vegyület legalább 12 szénatomot tartalmaz - alkalmazhatunk, 1-400 mg/1, előnyösen 2-200 mg/1 mennyiségben. A 37 255 sz. európai szabadalmi leírásban ismertetett módon, 0 *C és 37 'C, előnyösen 2 *C és 10 °C közötti hőmérsékleten, 7 és 11,5, előnyösen 9 és 11 közötti pH-tartományban, egy -SS03' csoportra számítva 1-5, előnyösen 2-3 -SH egységnek megfelelő mennyiségő merkaptán, előnyösen 2-merkapto-etanol, tioglikolsav vagy hasonlók jelenlétében, célszerűen oxigén messzemenő kizárásával lefolytatott diszulfidhíd-képzési reakció után kapott reakcióelegynek a találmány szerinti feldolgozás során a pH-érték átállítását pl. híg ásványi savak, mint sósav, kénsav vagy foszforsav hozzáadásával végezzük, de használhatók erre a célra az inzulin-perkurzorokkal reakcióba nem lépő szerves savak, mint ecetsav, vagy savanyú sók, mint foszfátok is. A pH-érték átállításakor kiváló csapadék centrifugálással könnyen elkülöníthető. Ezt a kivált csapadékot azután közvetlen szulfitolízissel, például a Swan [Nature, 180. 643-645 (1957)] által leírt módon, messzemenően visszaalakíthatjuk az S-szulfonát alakban. Ezt azután adott esetben kromatográfiás eljárással tisztíthatjuk, majd például a fentebb leírt módon, előnyösen valamely fiziológiailag ártalmatlan, fentebb leírt fajtájú felületaktív anyag csekély mennyiségének jelenlétében a kívánt diszulfidhidas inzulin-prekurzorrá alakítjuk át. Történhet azonban a feldolgozás a találmány szerinti eljárás egy további kiviteli alakja szerint oly módon is, hogy a merkaptán csekély feleslegével való kezelés útján kapott diszulfidhidakkal csak részlegesen kapcsolt inzulin-prekurzorhoz valamely fentebb leírt fajtájú felületaktív anyagot adunk, majd oxigént, például levegő-oxigént gyöngyöztetünk az oldaton keresztül és így folytatjuk le a reoxidációt. így a felületaktív anyag jelenléte meggátolja az inzulin-prekurzomak pl. a gázbuborékon bekövetkező denaturálódását. A fentiek értelmében a találmány szerinti eljárással a diszulfidhíd-képzési hozamot, a helytelen rekombinánsok visszanyerését is beleszámítva, mintegy 80, sőt egészen 90 %ig növelhetjük. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa Humán pre-proinzulin előállítása pre-proinzulin-S-szulfonátból 1,2 g (II) általános képletű pre-inzulin-S-szulfonátot, amely R helyén a Gly-Asn-Ser-Ala-Atg- preszekvenciát, Y helyén a -Lys- Thr- csoportot és X helyén a fenti humán X szekvenciát tartalmazza, feloldunk 2,5 liter 50 millimólos, 10,6 pH-értékű gáztalanított glicin-pufferoldatban, és 147 ml merkapto-etanol hozzáadásával éjjelen át lassan keverjük 4 *C hőmérsékleten. A reakcióközegben nagynyomású folyadék-kromatográfiás módszerrel mért diszulfidhíd-képzési hozam 0,32 mg/ml (az elméleti mennyiség 67 %-a); Staphylococcus aureus(Protease V8) alkalmazásával végzett „ujjlenyomat” (Fingerprint) elemzéssel megállapítottuk, hogy az A7-B7 diszulfidhíd 65 %-ban, a B19-A20 diszulfidhíd 93 %- ban jött létre. Az „ujjlenyomat’-analízist a következőképpen végezzük: egy 50 millimólos trisz-(hidroxi-metil)-metil-ammónium-klorid(„trisz”) pufferoldattal (pH=7,5) készített 0,5 mg/ml koncentrációjú inzulin-prekurzoroldat 200 ml-jéhez 0,1 egység S. aureus V8 proteázt adunk és az oldatot 37 *C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. Az így előkészített oldat egy alikvot-részét azután közvetlenül a nagynyomású folyadék-kromatográfiás berendezésbe visszük. A nagynyomású folyadék-kromatográfiás elemzést Cl8 fordítófázissal. 20-45 % B lineáris grádienssel végezzük. Az eljáráshoz A-pufferként 0,05 mól tetraetil-ammóniumfoszfátot, 0,25 mól nátrium-perklorátot és a teljes fázisban 10 % acetonitrilt tartalmazó, 3 pH-értékű pufferoldatot, B-pufferként 0,05 mól tetraammóniumfoszfátot és a teljes fázisban 90 % acetonitrilt tartalmazó, 3 pH-értékű pufferoldatot használunk. A körülbelül 7, 10 és 14 perc után fellépő fragmentcsúcsok viszonya alapján, eg)' humán-proinzulin standard figyelembevételével az adott kísérletben a fentebb émlített 65 % illetőleg 93 % értékeket állapítottuk meg. Az oldatot 9 pH-értékre állítjuk be és 25 mg felületaktív polietilén-propilén-glikolt adunk hozzá. Azután 4 °C-ra hűtjük és ezen a hőmérsékleten egy óra alatt kb. 50 liter oxigéngázt gyöngyöztetünk át az oldatotn. Ezt követően az oldatot 1 n sósavoldattal 5,4 pH-értékre savanyítjuk, amikor is zavarosodás következik be, amelyet centrifugálással eltávolítunk. A kapott csapadékot acetonnal és dietil-éterrel vagy metil-terc-butil-éterrel mossuk és megszárítjuk, súlya 520 mg. A tiszta szupematáns folyadékból 250 g nátrium-klorid hozzáadásával, 3 pH-értéknél leválasztjuk a natív pre-proinzulint. Hozam 720 mg (60 %). Az 5,4 pH-értéknél leválasztott csapadékot 100 ml 7 mólos karbamidoldatban 800 mg nátrium-szulfit és 600 mg nátrium- tetrationát hozzáadásával 7,6 pH-értéknél, 4 ’C hőmérsékleten szulfitolízisnek vetjük alá, és a reakcióterméket 3 pH-éitékű vizes puferoldattal szemben dializálva leválasztjuk. A csapadékot megszárítva 540 mg terméket kapunk, ennek 382 mg-nyi részét visszanyert pre-proinzulin-S-szulfonát képezi. Ezt 40 pl merkapto-etanollal a fentebb leírt módon redukáljuk, amikorís további 226 mg pre-proinzulint kapunk (ennek a lépésnek a külön számított hozama 59 %), így tehát a diszulfidhídképzés összhozama 946 mg (az elméleti mennyiség 78,8 %). Egy második, analóg módon megismételt műveletben az első művelet során kapott 144 mg anyagból 5,4 pH-értéken történő leválasztás útján további 78 mg natív pre-proinzulint kapunk (ennek a lépésnek a külön számított hozama 54 %). így tehát a teljes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
