200611. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-prekurzorok diszulfidhíd-képzéssel történő előállítása során kapott reakcióelegyek feldolgozására, a helytelen rekombinánsok hasznosításával
1 HU 200611 B 2 eljárásban a natív pre-proinzulin összhozama 1,024 g (az elméleti mennyiség 85,3 %-e). 2. példa Sertés proinzulin képzése és feldolgozása 0,4 g sertés-proinzulin-S-szulfonátot 800 ml 50 millimól/liter koncentrációjú, 10,5 pH-értékű glicinpufferoldatban 4 °C hőmérsékleten oldunk, az oldatot gáztalanítjuk és 49,1 mg tioglikolsavat adunk hozzá. Az oldatot 4 °C hőmérsékleten éjjelen át gyengén keverjük, majd 4 n sósavoldattal 5,2 pH-értékre állítjuk be, amikor is csapadék válik ki az oldatból. Ezt centrifiigálással elkülönítjük, acetonnal és dialkil-éterrel mossuk és megszántjuk; mennyisége 115 mg. A tiszta szupematáns folyadék nagynyomású folyadék kromatográfiai elemzés szerint 239 mg proinzulint tartalmaz, ami 60 %-os hozamnak felel meg. A csapadékot az 1. példában leírt módon szulfitolízisnek vetjük alá, amikor is 120 mg nyers terméket kapunk, amelyből a fentebb leírt kezelés útján 88 mg proinzulin-S-szulfonátot különítünk el. Ezt 12,3 mg tioglikolsavval az első bekezdésben leírt módon újból diszulfidhíd képzésnek vetjük alá. 5,2 pH-értéknél gyenge zavarosodás képződik; a reakcióelegyet centrifugálva további 43 g száraz anyagot kapunk. A centrifugálásnál kapott szupematáns folyadékot, amely nagynyomású folyadék-kromatográfiai elemzéssel meghatározva 55 mg proinzulint tartalmaz (az erre a lépésre számított hozam 62 %; az összhozam ennek megfelelően 73,5 %), egyesítjük az első lépésben 5,2 pH-értéknél végzett centrifugálás szupernatáns folyadékával. Az elegyhez 6 g trisz-(hidroxi-metil)-metil-ammónium-kloridot adunk, az oldatot 7,2 pH-értékre állítjuk be, majd 0,6 egység tripszint és 6 egység B-karboxipeptidázt adunk hozzá. Az oldtot 25 ”C hőmérsékleten gyengén keverjük és nagynyomású folyadékkromatográfiai vizsgálattal ellenőrizzük a reakció előrehaladását. Körülbelül 3-4- óra múlva a proinzulin teljesen eltűnik az oldatból; helyette C-peptid és sertés-inzulin képződött. A reakciót 40 ml 1 5-os cink-klorid-oldat hozzáadása és a pH- érték 5,4-re állítása útján befejezzük. Könnyen centrifugálható, pelyhes csapadék képződik, amely messzemenően sertés-inzulinból áll. A hozam 201 mg, ami a feldolgozott proinzulinra számítva 91 % termelési hányadnak felel meg. Az így elkülönített sertés-inzulin továbbtisztítása a szokásos módszerekkel, például ioncserélőn történhet. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a teljes inzulinvázat tartalmazó inzulin-prekurzoroknak a megfelelő nyíltláncú, az inzulin A-láncot és az inzulin B-láncot a cisztein-kénatomokon képezett S-szulfonátok alakjában tartalmazó előtermékből, valamely merkaptán jelenlétében, a nyíltláncú S-szulfonátot legfeljebb 10 mg/ml koncentrációban tartalmazó vizes közegben, 0 “C és 37 °C közötti hőmérsékleten, 7 és 11 közötti pH-értéknél lefolytatott diszulfidhíd-kapcsolási reakció útján történő előállítása során kapott reakcióelegyek feldolgozására, a helytelen rekombinánsok elkülönítésével és újbóli hasznosításával, azzal jellemez\e, hogy a reakcióelegyet, kívánt esetben 1-400 mg/1 fiziológiailag ártalmatlan felületaktív anyag, előnyösen polietilén- és/vagy polipropilén-glikol típusú vízben oldódó polimer hozzáadása után. 4 és 6 között pH értékre állítjuk be; a levált csapadékot elkülönítjük és szulfolízis útján visszaalakítjuk az inzulin A- láncot és inzulin B-láncot tartalmazó, újbóli diszulfidhíd-képzési reakciónak alávethető S-szulfonáttá. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felületaktív anyagként egy (III) általános képletű - ahol X jelentése 2-3 szénatomos alkoxicsoport, R- és R3 jelentése hidrogénatom, n jelentése egész szám 4 és 80, előnyösen 15 és 45 között, azzal a megszorítással, hogy a (III) általános képletű vegyület legalább 12 szénatomot tartalmaz - vegyületet alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felületaktív polimert 2-200 mg/1 mennyiségben adjuk a reakcióelegyhez. 5 10 15 20 25 30 35 40 4
