200487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új demetil-avermektin-származékok előállítására
1 HU 200487 B 2 és reakciókörülményekkel a 4 328 335 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom írja le. Az (I) általános képletű vegyületeket, ahol R3 jelentése hidrogénatom, előállíthatjuk a megfelelő vegyületekből is - ahol R3 jelentése metilcsoport - demetilezéssel. A reakciót úgy végezzük, hogy a 5-metoxi vegyületet vagy megfelelő védett származékát higany(II)-acetáttal reagáltatjuk és a kapott 3- -acetoxi-enol-étert híg savval hidrolizáljuk az 5-keto vegyülethez jutva. Ezt azután például nátrium-bórhidriddel redukáljuk 5-hidroxi-származékot nyerve. A reakciólépés alkalmas reagenseit és a reakciókörülményékét a 4 423 209 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom írja le. Az (I) általános képletnek megfelelő olyan vegyületeket, ahol R1 jelentése hidrogénatom és a kettőskötés hiányzik, előállíthatjuk olyan megfelelő vegyületből, ahol megvan a kettőskötés és az R1 hidrogénatom, a vegyület szelektív katalitikus hidrogénezésével, alkalmas katalizátort használva. Elvégezhetjük a redukciót például trisz(trifenil-foszfin)-ródium(I)-kloriddal, amint azt a 0.001.689 számú európai szabadalmi bejelentés és az ennek megfelelő, 4.199.569 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom leírja. Az (I) általános képletű demetil-avermektinek bioszintéziséhez a S. avermitilis R-COOH általános képletű vegyületeket vagy a fermentáció során ezekké átalakulni képes vegyületeket tud felhasználni. Ezeket a vegyületeket „primer vegyületeknek” hívjuk. Összefoglalva; ezek R-Z általános képlettel jellemezhetők, ahol R az előzőekben megadott, és Z -CH2OH, -CHO, -COOR6, -CH2NH2 vagy -CO-(l-4 szénatomszámú)-alkánkarbonsav-csoport, és R6 hidrogénatom vagy 1-4 szénatomszámú alkilcsoport. A találmány eljárása abban áll, hogy aerob körülmények között, adott esetben szinefungin jelenlétében a fenti S. avermitilis törzseket tenyésztjük nitrogénforrást, szénforrást, szervetlen sókat és R-COOH általános képletű vegyületet tartalmazó, vizes tápközegben. A savat az oltáskor vagy a fermentáció ideje alatt, adott időközönként adjuk a táptalajhoz. A hozzáadás történhet egyidőben vagy adagonként a fermentáció során. Az S-adenozil-metionint is adhatjuk az oltás idején vagy a fermentáció adott pontján, egyszerre vagy a fermentáció alatt adagokban, illetve folyamatosan. Az avermektin-termelés nyomonkövetéséhez mintákat veszünk a fermentléből, szerves oldószerrel extraháljuk, és a terméket kromagotráfiásan, például HPLC alkalmazásával mutatjuk ki. A fermentációt a termékképzés maximumáig folytatjuk, ez általában 4-15 nap időtartamot jelent. A primer vegyületek (karbonsavak) előnyös koncentrációja 0,05-3,0 gramm literenként. A primer vegyületet adhatjuk folyamatosan, megszakításokkal vagy egyszerre a táptalajhoz. Az RCOOH általános képletű savat alkalmazhatjuk szabad sav, sója - például nátrium-, lítium- vagy ammóniumsó - vagy a savvá átalakuló származéka formájában. A savat, amennyiben szilárd, előnyös alkalmas oldószerben, például vízben vagy 1-4 szénatomszámú alkoholban oldani. A szinefungint olyan időben és koncentrációban adjuk a tenyészethez, hogy ezzel a mikroorganizmus növekedését ne akadályozzuk. Általában 0,01-1,0 mM koncentrációban alkalmazzuk. Ezt a mennyiséget előnyösen a fermentáció 24-168 órás korában juttatjuk be. Előnyös a 0,05-0,50 mM, illetve a 0,05-0,25 mM koncentrációtartomány. A fermentációt szénforrást, nitrogénforrást és nyomelemeket tartalmazó szokásos tápközegben végezzük. Előnyös természetesen a táptalaj komponenseit úgy megválasztani, hogy olyan primer vegyületeket, ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butilcsoport ne, vagy csak minimális mennyiségben tartalmazzák. A fermentációt előnyösen 24—33 “C közötti hőmérséklettartományban végezzük. A fermentáció befejeztével a fermentlevet centrifugáljuk vagy szűrjük, és a micéliumot előnyösen acetonnal vagy metanollal extraháljuk. Az extraktumot betöményítjük, és a kívánt terméket vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, például metilén-kloriddal, etil-acetáttal, kloroformmal, butanollal vagy metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Az extraktumot bepároljuk, és a nyersterméket, ha szükséges tovább tisztítjuk kromatográfiával, például fordított fázisú HPLC segítségével. A termék rendszerint (I) általános képletű vegyületek keveréke, ahol R2-ben az R4 és R3 egyike, vagy mindkettő hidrogénatom; R1 jelentése hidroxilcsopoit és hiányzik a kenős kötés, vagy R1 hidrogénatom és megvan a kettős kötés; és R3 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport. A komponensek aránya változhat az adott mutánsoktól, a primer vegyülettől és - bizonyos mértékig - a szinefungin alkalmazott mennyiségétől, illetve a fermentációs körülményektől függően. Az R szubsztituens eredete, azaz, hogy a közvetlenül az RCOOH vegyületből, vagy a fenti előanyagok egyikéből vagy bármi más előanyagból származik, a dezmetil-avermektinek termelése szempontjából lényegtelen. A találmány szerinti eljárás kritikus követelménye viszont, hogy a kívánt R csoport az S. avermitilis számára a fermentációs folyamatok során hozzáférhető legyen. Alkalmas vegyületek a következők: 2,3-dimetil-vajsav 2-metil-hexánsav 2-metil-pént4-énsav ciklobután-karbonsav ciklopentán-karbonsav ciklohexán-karbonsav cikloheptán-karbonsav (S)-2-metil-pentánsav (R)-2-meti 1-pentánsav. Az O-metil-transzferáz mutánsokat az itt leírt elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz negatív mutánsokból kaptuk. Azon S. avermitilis mutánsok, melyekben az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitás mutációja kombinálódik az egyik vagy mindkettő O-metil-transzferáz aktivitás mutációjával, ha RCOOH általános képletű vegyületet. vagy a fermentációs folyamatok során ezzé átalakulni képes előanyagot adunk a táptalajhoz, főként B-avermektineket, demetil-avermektineket vagy demetil-B-avermektine-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
