200486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektor előállítására
1 HU 200486 A 2 A találmány tárgya eljárás új expressziós vektorok előállítására, amelyek az idegen gén kifejezésére alkalmas szokásos transzkripciós és transzlációs regulátor szekvenciákon - promoter, operátor, riboszóma-kötőhely, transzlációs startkodon, transzkripciós terminátorok, stb. - kívül egy 15-20 aminosavnyi ß-galaktozidáz részt kódoló szekvenciát, az operátor szekvenciának, vagy annak valamely részletének ismétlését, újabb riboszómakötőhelyet, transzlációs startkodont, egy 5-10 aminosavnyi homopolimer aminosavrészt kódoló szekvenciát, majd egy újabb ATG-kodont tartalmaznak. Az in vitro DNS rekombináció módszerével tetszőleges eredetű és információtartalmú gének juttathatók be a baktériumsejtekbe. Az, hogy az idegen DNS stabilan fennmaradjon a sejtben, és a benne kódolt információ kifejeződjék, megfelelő hordozó molekulákkal: expressziós (kifejező) vektorokkal biztosítható. Egy fehérjét kódoló gén baktériumsejtben történő expressziójakor (kifejezésekor) a baktériumsejt enzimei előbb a transzkripció során a DNS-ről mRNS-t szintetizálnak, majd erről a transzláció során polipeptidet. Az expressziót egy úgynevezett promoter régió iniciálja. Az RNS polimeráz ezt a promotert ismeri fel, és ehhez kötődik a transzkripció iniciálása során. Gyakorlatban az in vitro DNS rekombináció módszere akkor alkalmazható gazdaságosan, ha a célzott fehérje kielégítő mennyiségben keletkezik, azaz, ha mind a transzkripció, mind a transzláció megfelelő intenzitású, és a keletkező mRNS, illetve a szintetizált fehérje megfelelően stabil a hordozó sejtben. Idegen - eukaryota - gének expressziója számos esetben rendkívüli nehézségekbe ütközhet az alábbi okok miatt:- a géntermék toxikus a gazdasejtre- az adott génről szintetizálódott m-RNS baktériumsejtben nem stabil- maga a géntermék - fehérje - gyorsan degradálódik, nem halmozódik fel. Az első nehézség egy adott pillanatban beindítható, szabályozható promoter segítségével hidalható át, amelyet akkor kapcsol be a felhasználó, amikor a baktériumok már kellő sűrűséget értek el. Ekkor már nem jelent problémát, hogy a továbbiakban csak a termék szintézise folyik a sejtekben, további osztódás nincs, az életkörülmények - éppen a termék szintézise és toxicitása miatt - nem ideálisak a gazdasejt számára. Az mRNS és fehérje szintű védelmet a termeltetni kívánt gén „álcázásával” érik el a legtöbb esetben, mégpedig úgy, hogy egy bakteriális eredetű fehérje génjének egy darabját fúzionáltatják a termék génjének 5’ végéhez. Ez a védőpeptid a legtöbb esetben a ß-galaktozidáz enzim egy darabja, amelynek mennyiségi aránya a fúziós termékben általában igen magas, mivel minimálisan 150 aminosavnyi szakasz szükséges a védelemhez. E körülmény továbbiakban a termék tisztításánál jelent hátrányt, mivel egyrészt a ténylegesen hasznos fehérje aránya kicsi a fúziós proteinben, másrészt a legelterjedtebb elválasztási eljárás, a BrCN-os hasítás során több fragment keletkezik, melyek közül nehéz kiválasztani az autentikusát. Nemrégiben fejlesztették ki és írták le idegen fehérjék védelmére E. coli baktériumsejtekben egy rövid homopolimer aminosavrészt kódoló farok fúzióját a gén 5’ végéhez (Wing L. Sung et. al.: Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequence enhance accumulation of human proinsulin synthesized in Escherichia coli, Proc.Natl.Acad.Sci. USA Vol. 83, pp. 561-565, 1986). Néhány aminosav esetében (Thr, Gin, Ser) rendkívül jó expressziót (az összfehérje 6-26 %-a) sikerült elérni, és jelentősen megnőtt a fúziós fehérjén belül a hasznos termék aránya, hiszen a homopolimer rész mindössze 6-8 aminosavból állt. Ez a vektor azonban nem használható univerzálisan, mint a találmányunk szerinti vektor. Ennek oka az, hogy a fenti cikkben leírt rövid három aminosav hosszúságú ß-galaktozidäzt kódoló szekvencia nem nyújt megfelelő mRNS szintű védelmet A cikkből kiviláglik, hogy a szerzők nem is tulajdonítottak jelentőséget a fenti szekvenciának, mivel a korábbi kísérletek alapján azt feltételezték, hogy csak a szokásos hosszúságú (kb. 150 aminosavat kódoló) szekvencia fejthet ki ilyen jellegű stabilizáló hatást. Kísérleteink során meglepő módon azt találtuk, hogy az mRNS-szintű védelem elérhető oly módon, ha a monoton aminosavakat kódoló régiót egy rövid (kb. 15-20 aminosavat kódoló) ß-galaktozidäz gén szakasz mögé, és az expresszáltatni kívánt gén elé inszertáljuk. Ez a „szendvics” elrendezés biztosítja a hatékony mRNS és fehérje szintű védelmet. Következtetéseink szerint a ß-galaktozidäz kódoló résznek főként az mRNS szinten, míg a homopolimer aminosav faroknak a fehérje szinten van nagyobb jelentősége. Célunk az volt, hogy olyan új expressziós vektort hozzunk létre, amely jó fehérje hozamot biztosít, ugyanakkor megbízhatóan szabályozható, és tetszőleges kifejeztetni kívánt gén esetén is biztosítja a megfelelő mRNS illetve fehérje szintű stabilitást. A 197 595 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett pERVl/23 expressziós vektorcsalád megfelelő tagjaiból in vitro DNS rekombinációs technikák felhasználásával létrehoztuk a fenti követelményeknek eleget tevő pER 23 threo-alpha plazmidot. (A plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 2/a ábrán szemléltetjük.) E plazmid kialakítását az a felismerésünk tette lehetővé, hogy egy meglepően rövid (40-60 nukleotidnyi) ß-galaktozidäzt kódoló szakasz és egy homopolimer aminosavszekvenciát kódoló nukleotid szakasz alkalmazásával jelentős mRNS és fehérje szintű védelmet sikerült elérni. Ezenfelül egy újabb, majdnem teljes operátor régió beépítésével még tökéletesebbé vált a vektor szabályozhatósága. További riboszómakötőhely és transzlációs startkodon beépítésével elértük, hogy jelentősen bővült a vektorunkkal előállítható fehérjék köre. A találmány tárgya tehát eljárás új expressziós vektor előállítására homopolimer aminosavrészt kódoló szekvencia beépítésével, amely abban áll, hogy a pERVl/23 vektorcsalád valamely tagjába a promóter, operátor, riboszómakötőhely és transzlációs startkodon régiói után - az expresszáltatni kívánt gén elé - egy 15-20 aminosavnyi ß-galaktozidäz részt kódoló szekvenciát, az operátor szekvencia, vagy annak valamely részlete megismétlését, újabb riboszómakötőhelyet, transzlációs startkodont, egy 5-10 aminosavnyi homopolimer aminosavrészt kódoló szekvenciát, majd egy újabb ATG-kodont építünk be. A találmány szerinti expressziós vektor és a vele biztosított génexpresszió főbb jellegzetességei a következők: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 1
