200486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektor előállítására
1 HU 200486 A 2 - a vektor rendkívül erős regulálható promotert hordoz;- az mRNS és fehérje szinti! védelmet az expresszáltatni kívánt gén előtt elhelyezkedő ß-galaktozidáz részt kódoló szekvencia, és a homopolimer aminosav részt kódoló szekvencia alapján szintetizálódó homopolimer aminosav farok látja el;- a farok hossza összesen csupán kb. 40 aminosav, ami a termék tisztítását lényegesen megkönnyíti;- a kifejeztetni kívánt gén elé beépített ATG-kodon következtében egyszerű BrCN-os hasítással leválaszthatjuk a termék fehérjéről a további, nemkívánatos, fuzionált fehérjerészeket;- a ß-galaktozidäzt kódoló részt követően egy második, csaknem teljesen ép lac operátor szekvencia található (a ß-galaktozidäzt kódoló résszel és az aminosavakat kódoló szekvenciával azonos leolvasási fázisban). Ez a második operátor az első - promoter mögötti - intakt operátor szakasszal együtt tökéletessé teszi a repressziót még olyan erős promoter mögött is, mint a riboszómális RNS operon p2 promoteréből és az E. coli lac operon szabályozó szekvenciáiból kialakított 6/23 promoter (lásd 197 595 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás);- a ß-galaktozidäzt kódoló rész mögött és a homopolimer aminosavakat kódoló szekvencia előtt egy második riboszómakötőhely és transzlációs startkodon található. Kísérleti adatok arra mutatnak, hogy bizonyos fehérjék esetén csak az első vagy második, míg más esetekben mindkét transzlációs szignál felhasználődik, így gyakorlatilag a rendszer szabadsági foka nőtt meg azáltal, hogy a baktérium transzlációs apparátusa maga választhatja meg a számára optimálisabb, könnyebben elérhető szignált;- a vektor alkalmas bármely más, Clal linkerekkel ellátott, ill. a vektor Clal helyére beépített fehérje gén expressziójára (természetesen a polilinkerben lévő egyéb restrikciós helyek is felhasználhatók);- különböző fehérjék egylépéses, immunológiai módszeren alapuló tisztítására is lehetőség kínálkozik a monoton aminosav farok segítségével;- az eddig kipróbálásra került gének esetében (humán proinzulin, szintetikus inzulin A és B lánc, vasoaktiv intentirális polipeptid) a vektorral igen magasszintű (az ossz sejtfehérje 25-30 %-át kitevő) expressziót sikerült elérni. A fenti expressziós vektor felépítésére kidolgozott találmány szerinti eljárás előnyösen az alábbi - későbbiekben részletezendő - lépéseket foglalja magába. 1. Kiválasztunk egy olyan peptidet, melynek génje klónozott formában rendelkezésünkre áll, és amely peptidiől ismert, hogy E. coli sejtben rendkívül instabil (pl. humán proinzulin). 2. A gén 5’ végéhez (kezdetéhez) Clal linkért ligálunk úgy, hogy a Cla I linker utolsó 3 nukleotidja (ATG) közvetlenül megelőzze a gén első aminosavát kódoló nukleotid triplet« (az ATG kodon által kódolt metionin aminosav a fúziós termék BtCN-os hasítását teszi lehetővé), majd a Cla I linkerrel kezdődő gént egy alkalmas plazmidban klónozzuk, lac regulátor szekvenciákat (operátor és riboszómakötőhely) követően. 3. Az így kapott plazmid egyedi Cla I restrikciós helyére beépítünk egy szintetikus oligonukleotidot, amely néhány treonin aminosav egymást követő kodonját tartalmazza. Helyes orientációjú beépülés esetén egyrészt a threoninok azonos leolvasási fázisban vannak a génnel, másrészt a Cla I hely az oligonukleotidnak csak a génhez közelebbi végénél regenerálódik. 4. Az így kapott plazmidból a- lac regulátor régiót;- a treoninokat kódoló oligonukleotidot;- Cla I linkért;- valamint a gént tartalmazó DNS darabot alkalmas restrikciós enzimmel vagy enzimekkel kivágjuk és a pER VI/23 plazmidcsalád valamely tagjának a-peptid kódoló régiójában lévő egyedi PvuII restrikciós helyre klónozzuk, úgy, hogy a PvuII helynek megfelelő pozícióban egyedi restrikciós hely (R) generálódjék. Az így kapott plazmid releváns régiójában az alábbi funkciójú DNS szakaszok találhatók egymást követően; 6/23 promoter, lac regulátor régió I; az a-peptid első 34 aminosavát kódoló DNS szakasz; R egyedi restrikciós hely, lac regulátor régió II; a monoton threonin oligopeptidet kódoló DNS szakasz; Cla I linker az ATG kodonnal; valamint a stabilizálni kívánt peptid génje. 5. A következő lépésben az R restrikciós enzim helyet felhasználva a plazmidot linearizáljuk, majd Bal 31 exonukleázzal deléciósorozatot képezünk, olyan körülmények között, hogy az enzim legfeljebb néhányszor 10 nukleotidot emésszen le, majd a plazmidokat DNS ligázzal recirkularizáljuk. 6. Transzformálás után olyan klőnokat keresünk, melyek nagy mennyiségben expresszálnak - a kívánt mérettartományba eső - idegen fehérjét 7. Immunológiai módszerrel (RIA, immunobiot) igazoljuk, hogy a termelt fúziós peptid valóban tartalmazza a kifejeztetni kívánt fehérjét 8. A plazmid pontos nukleotid sorrendjét szekvenciázással állapítjuk meg. 9. A Cla I restrikciós hely felhasználásával a gént hordozó DNS darabot kicseréljük egy polilinker szekvenciára, amely lehetőséget nyújt tetszőleges egyéb peptidek génjeinek klónozására. A találmány szerinti eljárást az alábbi példával szemléltetjük részletesebben, anélkül, hogy igényünket a példában ismertetettekre korlátoznánk. 1. példa A pER 23 Threo a plazmid elkészítése A konstrukció előállítása során 3 különböző plazmidból indultunk ki: pSzI 153, pERVI/23 PLH4, pERVI/23(+ATG). A pSzI 153 elnevezésű plazmid a 4363/84 alapszámú bejelentésünk között szerepel, a másik kettő pedig a 197 595 lajstromszámú szabadalmi leírásban ismertetett vektorcsalád tagja. A pSzI 153 plazmidból a humán proinzulint kódoló DNS szakaszt Clal és Hind m restrikciós enzimekkel kivágjuk, ahol a kivágott DNS fragmentumon a Cla I linkéiből származó nukleotid triplet« követően közvetlenül a fehéije első aminosavát kódoló TIT kodon következik. Az első lépésben a Cla I, Hind ül restrikciós enzimekkel történő emésztéssel kapott DNS fragmentumot (proinzulin gént) a pER23(+ATG) plazmid polilinker régiójában található Cla I, Hind in helyre klónozzuk. Második lépésben az így előállított plazmid - továbbiakban Intermedier I - Cla I helyére, a pro-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
