200477. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tripeptid-aldehidek előállítására
1 HU 200 477 A 2 A találmány tárgya javítóit eljárás gyógyszerkószítéshez megfelelő tisztaságú, I általános képlclű tripcptid-aldehidek előállítására - ahol R jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport, Phe jelentése fcnilalanin-csoport Pro és Arg jelentése L-prolin- illetve L-arginin-csoport a szakirodalomnak megfelelően [pl. Biochcm. 7, 126,773 (1972); Biochemistry 14,449 (1975)]. A gyógyszerkészítéshez jelen esetben legalább 95%-os tisztaságú hatóanyag szükséges. Ismeretes, hogy a D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldchid (H-D-Phe- Pro-Arg-H) sói jelentős antitrombin aktivitással rendelkeznek. A169 870. számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett acctál-só terápiás felhasználásra azonban nem alkalmas, a szilárd állapotban és a vizes oldatban egyaránt gyorsan bekövetkező aktivitás-vesztés következtében. Hasonlóan viselkedik a klórhidrát-, citrát-, tartarát-, tozilátsó és a tripeptid-aldchid NG-karboxiszármazéka is. Viszont vizes oldatban is nagy stabilitással rendelkezik a H-D-Phe-Pro-Arg-H szulfát-sója (184 368. számú magyar szabadalmi leírás) és ez utóbbi N-mclil-származéka (192 646. számú magyar szabadalmi leírás), melyek ennélfogva alkalmasak lehetnek terápiás felhasználásra. A fenti szulfát-sók az alábbiak szerint állíthatók elő: 1. A H-D-Phe-Pro-Arg-H-szulfát a 184 368 számú magyar szabadalmi leírás szerint előállítható a tcrc-butiloxi-karbonil-D-fcnilalanil-L-prolil-L-arginin-aldchid-hcmiszulfátból vagy a tcrc-butiloxi-karbonil-D-fcnilalanil-L-prolil-N°-karboxi-L-arginin-aldchidből 1-12 ekvivalens mennyiségű 1-12 n vizes kénsavval 40-60 'C-on. (Az előbbi kiindulási anyag előállítását ugyanezen bejelentés 1. példája, a védett NG-karboxiszármazék előállítását a 177 098 számú magyar szabadalmi leírás ismerteti.) 2. Továbbá ugyanezen leírás szerint előállítható benziloxi-karbonil-D-fcnilaIanil-L-prolil-NG-bcnziloxi-karbonil-L-arginin-aldchid [Z-D-Phc-Pro-Arg(Z)-H] hidrogcnolízisévcl mólekvivalcns mennyiségű kénsav jelenlétében, (Akiindulási kétszeresen védett tripeptidaldchid előállítását a 169 870 számú magyar szabadalmi leírás ismerteti.) 3. Az N-mctií-D-fcnilalanil-L-prolil-L-arginin-aldchid-szulfálot (H-D-MePhe-Pro-Arg-H.H2S04) a 192 646 számú magyar szaadalmi leírás szerint a szabad tripcptid-aldchid-szulfálhoz hasonlóan úgy állítják elő, hogy az N-bcnziloxi-karbonil-N-mctil-D-fcnilalanil-L-prolil-NG-bcnziloxi-karbonil-L-arginin-aldchidről a vódőcsoportokat kénsav jelenlétében végzett hidrogcnolizisscl eltávolítják. (A kiindulási védett tripeptid-aldchid előállítását ugyanezen szabadalmi leírás ismerteti.) Ezen eljárások legfőbb hátránya abban áll, hogy - különösen nagy léptékű gyártás esetén - nem eredményeznek kellő tisztaságú terméket: így az 1. eljárással kapott termék a szóban forgó szabadalmi leírás szerint is mintegy 4-6% kalcium-szulfátot tartalmaz. Vékonyréteg kromatográfiás vizsgálataink szerint az így nyert termék a fenti són kívül mintegy 10%-ot is meghaladó mennyiségű egyéb szennyezést (pl. tripcptid-alkohol, -sav, -acctál), összességében 20%-ot is meghaladó idegen anyagot tartalmazhat. Ezen eljárás további hátránya, hogy nehézséget okoz a kénsav-felcslcg semlegesítése és a kivált kálcium-szulfát szűrése. A 2. és 3. eljárással (hidrogenolízis) előállított tripeptid-aldchid-szulfát-sók a vékonyréteg kromatográfiával kimutatható 5-10% szennyezés mellett a HPLC vizsgálatok szerint mintegy 10—15% D-L-D konfigurációjú tripcptid-aldchid-szulfálol is tartalmazhatnak, így öszszcsen 15-25% melléktermék keletkezhet. A kromatográfiával kimutatható 5-10% szennyezés ebben az esetben a következőkből tevődik össze: a tripeptid-aldchid szintézise során keletkező tripeptid-sav, tripcplid-alkohol, a H-D-Phe-Pro-Arg-H esetén egy gyűrűs bomlástermék, melynek szerkezetét a 192 646 számú magyar szabadalmi leírásban ismertettük, és egy változó mennyiségben keletkező ismeretlen szerkezetű anyag, amelynek foltja a főle rmok foltja alatt helyezkedik cl a kromatogrammon. Megfigyeltük, hogy ez utóbbi melléktermék képződésében fontos szerepet játszik a „túlhidrálás”: Ugyanis ha a hidrogcnolízist ismert módon, azaz szobahőmérsékleten 1 mól ekvivalens kénsav jelenlétében végezzük és a reakció végbemenőidé után is folytatjuk, a vékonyréteg kromatogrammon (adszorbens; Kicsclgcl G, clucns: ctil-acctát-pridin-ccctsav-víz - 25: 20:6:11, előhívó: klór-tolidin) minden cselben megjelenik a termék foltja (H-D-Phc-Pro-Arg-H.H2S04 esetében Rf = = 0,52-0,57) alatt az Rf = 0,39-0,44 értékű folt, amely esetenként a fő szennyező folt. Ennek elkerüléséhez szükség van a reakció végpontjának pontos detektálására és a reakció végpontban történő leállítására. Ez azonban - különösen ipari körülmények közölt - nem oldható meg, mivel a reakció végpontjának megállapítása vékonyréteg kromatográfiás vizsgálattal történik, mely az adott fenti futlatóclcgy esetén 20-30 percet igényel, így a „túlhidrálás” miatt általában 3-4%-ban képződik a fent megadott Rt értékű melléktermék. Ennek eliminálására azért is feltétlenül szükség van, mert toxikusabb, mint az anyag. Mivel a végtermék fokozottan hajlamos a raccmizációra, ezért az ismert eljárások során keletkezett szennyező anyagok a végtermékből gyakorlatilag nem távolíthatók cl. Csak a köztitermékek többszöri oszlopkromatográfiás tisztításával - ami rendkívül költséges - lehetett némi eredményt elérni. Mivel a végtermék nem tisztítható, a fenti cél eléréséhez meg kellett oldani egyrészt a köztitermékek megfelelő tisztaságban történő előállítását, ami elsősorban a raccmizáció megakadályozását jelenti az eljárás során, másrészt az utolsó lépésnél, a hidrogcnolízisnél a melléktermék-képződés visszaszorítását. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, mellyel a fenti melléktermékek képződése visszaszorítható, és legalább 95%-os tisztaságú I általános képlctű tripeptidaldchid-sók állíthatók elő. Felismertük, h|)gy a D-L-D termék képződését, azaz a raccmizációl, ajpH igen nagy mértékben befolyásolja. Lugos pH-jú közegben igen gyorsan, de már semleges pH-n is raccmizálódik a végtermék és a köztitermékek is. Savas közegben (pH=2) hónapokon keresztül stabil a végtermék. Tehát olyan technológiát kellett kidolgozni, amely biztosítja, hogy az eljárás egész folyamán rövidebb időre se legyen semleges vagy lúgos a rcakcióelegy pH-ja. E célból a IV képlclű NG-bcnziloxi-karbonil-L-arginin-laktám-klórhidrát és az V általános képlctű dipeptid 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
